[发明专利]一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法、生产模块及在生产中的应用

说明书

本发明提供了一种生物大分子上游生产过程中分阶段截留的生产方法、配合该方法使用的生产模块以及该方法/模块在工业化生产多肽、融合蛋白以及免疫球蛋白分子上的应用。本发明的方法可以有效地实现大规模重组蛋白上游工艺的效率、产量和纯度的提高。

技术领域

本发明属于生物制品生产领域，更具体地，涉及到生物大分子的工业化生产，特别是多肽、融合蛋白或免疫球蛋白的上游工艺制备。

背景技术

生物大分子，特别是融合蛋白与免疫球蛋白分子是当今生物制药领域的热点，其生产需要经过细胞培养的上游工艺制备，再从细胞培养液中获得、纯化、精制、浓缩的下游工艺制备过程，以及将抗体分子置于适于人体的制剂溶液的制剂工艺制备三个主要步骤。

在上游工艺中用于生产重组蛋白的表达体系主要是建立在哺乳动物细胞培养体系中，一般从工作细胞库的单个储存管的细胞活化开始，经过三角瓶，2升，10升，50升，然后到500升的细胞反应器生产。由于细胞培养过程中所涉及的培养基成分多达70-80种，且在细胞培养过程中还可能在细胞反应其中积累分泌的蛋白酶类、小的细胞碎片及宿主细胞蛋白、DNA、RNA分子等多种杂质。同时，还包括残缺的抗体分子或者由于氧化还原造成电荷分布不一样的抗体分子等，因此下游工艺中需要使用离心法和深层过滤去除细胞后，再用蛋白A亲和层析法完成抗体的收获，这一步骤的产品收率大于95％，但此时不仅收获了绝大多数带有Fc片段的完整抗体分子，还同时将残缺的抗体分子等和产品性质相关的杂质一并收获从而导致在其后的纯化和精制步骤中操作难度很大。因此，在这样的情况下，为了保证产品的高质量，或者不同生产批次的相似性，下游工艺的纯化和精制步骤往往是以牺牲产率作为结果的。

现有的生物大分子的大规模工业生产的上游细胞培养阶段常采用灌注培养(perfusion culture)与分批补料培养(fed-batch culture)两种形式，再结合不同的细胞截留工艺，以实现高密度的细胞培养，同时达到细胞培养液中杂质的过滤。ATF技术(Alternating Tangential Flow Filtration，交替切向流过滤)是一种最先进的截留工艺，这是一种保证对细胞低剪切力、较大的过滤面积且强的抗堵塞能力的过滤系统，可以实现高密度的细胞过滤培养。然而，在实际操作过程中，由于细胞的不断生长，会在细胞大规模培养过程中累积产生除了表达蛋白之外的不同性质的代谢产物或产品相关杂质，如在细胞培养的初期主要在培养基中累积细胞代谢产物，同时在细胞大量扩展初期的培养条件下，会在培养基中产生少量的抗体产物，这部分的抗体产物易于受初期培养温度较高等条件影响，发生脱氨或降解等变化，成为产品相关物质或杂质。这些代谢产物和产品相关杂质随着细胞与期望蛋白的浓度升高，将会直接影响最终蛋白产物的产量和纯度，更将影响蛋白产物的天然构象，可能造成高浓度蛋白的相互聚集，造成企业后期处理重大的成本和时间上投入，乃至不可挽回的损失。

因此，现有生物大分子在上游生产工艺中的局限使得企业中难以在短时间内按时间表实现高质量，高速度和高产出转化为产品，故亟待寻求一种生产解决方案，用于克服在上游生产阶段细胞培养过程中的代谢产物和产品相关杂质对生产的影响问题。

发明内容

本发明提供了一种生物大分子上游生产过程中分阶段截留的生产方法、配合该方法使用的生产模块以及该方法/模块在工业化生产多肽、融合蛋白以及免疫球蛋白分子上的应用，利用该方法，可以有效地实现大规模重组蛋白上游工艺的效率、产量和纯度的提高。

本发明的第一方面，提供了一种生物大分子上游分阶段截留的生产方法，包括使用生物反应器结合截留系统的生产方式，所述方法至少包含两个生产阶段，在第一生产阶段，使用包含第一过滤模块的截留系统，所述的第一过滤模块包含有滤孔为0.05μm-1μm的过滤组件；在第二生产阶段，使用包含有第二过滤模块的截留系统，所述的第二过滤模块包含有滤孔的截留分子量相对于产物分子量1/15～2/3过滤组件。

在一优选实施例中，所述的第一过滤模块包含有滤孔为0.1μm-0.5μm，优选地为0.2μm-0.3μm的过滤组件。