[发明专利]一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法

说明书

本发明公开了一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法，是将含有外源DNA的质粒导入根癌农杆菌中，得到重组农杆菌，将所得到的重组农杆菌用如下溶液进行悬浮后，通过自制的工具，在大豆开花的当天下午3～4点对大豆的子房壁进行针扎和注射处理，进行遗传转化:溶剂为水，溶质是非离子表面活性剂Sillwet L‑77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L‑77的体积百分比浓度为0.1％‑0.3％，蔗糖的质量百分比浓度为5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.003％。利用本方法将一个大豆热激蛋白90合成相关的基因导入大豆植株中，获得转基因大豆植株。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法。

背景技术

1988年由Hinchee报道大豆转基因植株的获得开始，大豆转基因技术以其定向改造和育种年限短等优点，开始发展成为一种重要的大豆育种手段。大豆转基因中常用 的转基因方法是农杆菌介导法，基因枪法和花粉管通道法，其它转化方法应用得较少。

农杆菌介导法是运用较广泛的一种大豆转化方法，其优点是操作简单、研究费用较低，转基因植株通常以单拷贝或低拷贝形式存在，后代遗传表现较稳定。但其缺点 是转化频率较低，无论是植株的再生还是转化的过程都有较强的基因型依赖性，受限 制因素较多。

基因枪法也是运用较广泛的一种遗传转化方法，其优点是受体材料的影响较小，不受受体基因型和轰击靶组织的限制，转化效率相对高，操作简便，可控度高。但也 具有一定的缺点，比如研究费用较昂贵、转化率偏低，转化过程中经常发生重排和高 拷贝插入现象，容易导致外源基因的失活和后代遗传规律紊乱，使后期筛选能够表达 目的基因转基因植株比较困难，在植物基因组中拷贝数高，易引起基因沉默。

花粉管通道法摆脱了受体再生条件的限制，转化过程完成后能直接获得转基因受体的种子，减少了时间周期，但因为其转化效率极低，操作要求高，而且有转化目标 混乱等问题，所以应用较少。

因此，寻找一种能在大田条件下规模化进行转化大豆工作，且操作要求低转化效率高的转化方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法。

一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法，其特征在于具体包括如下步骤：

选取携带目的基因的根癌农杆菌培养至OD₆₀₀值在0.8-1.2，离心后去上清液,加入与弃去的上清液等体积的溶液A,混匀得农杆菌转化液；选取大豆开花的当天下午3～4点对大豆的子房壁进行注射农杆菌转化液处理，操作完成后加套塑料袋保湿，维持至次 日凌晨5:00～6:00；其中,所述的溶液A以水为溶剂，溶质为非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.1％-0.3％，蔗 糖的质量百分比浓度为3％-5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.001-0.004％，乙酰 丁香酮用适量二甲基亚砜溶解。

本发明方法适用于所有大豆品种所述的大豆品种优选Williams 82、南农88-31、猴子毛。

所述的注射农杆菌转化液采用注射器注射或采用以下自制注射工具处理；自制注射工具是将市售胶头吸管，吸水处通过火烧等加热方法，将管口直径控制在0.5毫米 之内，其结构基本是一端是市售的胶头滴管，一端是直径小于0.5毫米的注射口，中 间长度不限。

所述的溶液A优选以水为溶剂，溶质为非离子表面活性剂Sillwet L-77，蔗糖和乙酰丁香酮；其中，Sillwet L-77的体积百分比浓度为0.1％-0.3％，蔗糖的质量百分 比浓度为5％，乙酰丁香酮的质量百分比浓度为0.003％，乙酰丁香酮用适量二甲基亚砜 溶解。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：