[发明专利]利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法及所得新型酿酒酵母

权利要求书

1.一种利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株为出发菌株，利用优化的产孢条件分别诱导酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株形成子囊孢子；

利用溶壁酶分别将酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株的子囊孢子中的单倍体孢子释放出来，收集单倍体孢子悬液，并将单倍体孢子从各自的单倍体孢子悬液中分离出来；

将分离得到的两种单倍体孢子进行融合，于含有乙醇浓度为12％的麦汁培养基中进行培养，得到所述新型酿酒酵母。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述优化的产孢条件具体为：

分别取于30℃下培养24h的酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株，3500r/min离心10min，收集菌体；

用无菌水各洗3次后，分别接种于20mlYPK培养基中，在28℃下以200r/min培养1天；

离心收集两种培养物的1/3的细胞，用生理盐水洗3次后，再分别接种于产孢培养基上于25℃培养24小时，直至所观察检测到的OD值为600。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述产孢培养基包括1％乙酸钾、0.1％酵母粉、0.05％葡萄糖、0.005％腺苷、0.005％尿嘧啶、0.01％色氨酸、0.01％亮氨酸、0.01％组氨酸和琼脂2％。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在利用溶壁酶分别将酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株的子囊孢子中的单倍体孢子释放出来之前，还包括检测鉴定单倍体孢子的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述鉴定单倍体孢子的步骤具体为：

取产孢培养基上的菌体少许，进行涂片、干燥，过酒精灯2-3次，放至冷却；

加数滴石碳酸复红染液，在火焰上加热5-10min至冒气，放至冷却，水洗；加酸性酒精脱色30s，水洗；加美兰染色1min，水洗，用吸水纸吸干；制片干燥后，镜检。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用溶壁酶分别将酿酒酵母和耐酒精低产乙醛酵母菌株的子囊孢子中的单倍体孢子释放出来具体为：

将产孢培养基中已形成的菌体以3000r/min离心10min，收集细胞；

将离心获得的细胞分别重悬于5ml缓冲溶液中，于30℃培养10min，以3000r/min离心10min；再重悬于缓冲溶液，加0.5mg溶壁酶，于30℃培养30min，以3000r/min离心10min；再重悬于2ml缓冲溶液中于30℃培养30min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，收集单倍体孢子悬液，并将单倍体孢子从各自的单倍体孢子悬液中分离出来具体为：

分别将单倍体孢子悬液于60℃水浴处理10min，杀死悬液中所含有的营养细胞，冷却、离心，收集单倍体孢子。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将分离得到的两种单倍体孢子进行融合具体为：

将分离得到的两种单倍体孢子接种于40mlYPD培养基中，于30℃以100r/min培养24h。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，将融合后的菌株按1％的接种量接入到含有乙醇浓度为12％的麦芽汁液体培养基中，30℃静置培养观察，若融合后的菌株能够正常产气，判断得到所述酿酒酵母。

10.一种如权利要求1-9任一项所述的利用基因组重组技术制备新型酿酒酵母的方法制备得到的新型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SCHL1706，保藏编号为CGMCCNO.14231。