[发明专利]多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了多功能植物双元质粒pPBEL‑BiFC的构建方法及其应用，属于基因工程技术领域，该方法包括以下步骤：改造原有的多克隆位点，把原有的MCS区进行敲除，引入两段新的MCS区，可以有更多的酶切位点选择。对原有的GFP进行改造，代替GFP，引入YFP‑C段和YFP‑N段在载体的不同位置，YFP‑C段和YFP‑N段分别在两个载体的局面。引入了HA和MYC标签，能进行western‑blot蛋白检测，HA上连接A蛋白，MYC上连接B蛋白，通过检测A蛋白进行western‑blot分析，进而检测是否有B蛋白存在，反之亦然。本发明构建的质粒能进行Co‑IP免疫共沉淀反应。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种用于两个不同目的蛋白质表达和互作的多功能植物双元质粒(pPBEL-BiFC)的构建方法及其应用。

背景技术

本质粒的基本骨架是基于pCambia1302载体，但pCambia1302只能做单个基因的表达，无HA,MYC标签，不能使用通用的标签序列进行Western blot分析。新构建的载体具有同时表达分别带有HA和Myc标签的两个不同的外源蛋白并分别与YFPN¹⁷³和YFPC¹⁵⁵同框(in-frame)表达融合蛋白，原有载体不能进行Co-IP免疫共沉淀反应，不能进行双分子荧光互补(BiFC)试验，重新分布、增加和排列了多克隆位点，两个多克隆位点区域(MCS)中每一个每个切点均是唯一的，每个多克隆位点区域(MCS1和MCS2)分别含有一个平末端酶切点SmaI和PmlI。

发明内容

本发明的目的在于解决原有的pCambia1302载体存在的缺陷，为了高效率进行植物蛋白质功能的研究，对只能做蛋白质在植物细胞定位的植物表达载体pCambia1302进行了系统改造，构建成新多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC，提供了一种新型的用于蛋白质表达和蛋白质互作的多功能植物载体。

其具体技术方案为：

多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的构建方法，包括以下步骤：

步骤1.消除了原有的多克隆位点MCS区，在另外部位即HA和Myc标签的后部引入两段新的MCS区域，可以有更多的酶切位点选择，方便在这两个标签之后插入目的基因。

步骤2.利用NcoI和BstEII双酶切消除原有的GFP基因和酶切点，引入HA标签序列，再紧随其后加上多克隆位点(MCS)和YFPC¹⁵⁵序列。

步骤3.用XhoI切除Hygromycin抗性基因，加上Myc从标签序列，再紧随其后加上多克隆位点(MCS)和YFPN¹⁷³序列。

本发明所述的多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。HA标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；多克隆位点1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；YFPN¹⁷³的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；多克隆位点2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；YFPC¹⁵⁵的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明新构建的质粒具有同时在植物细胞、原生质体、组织中表达两个不同融合蛋白质，以进行生物化学、生物物理学等方面的研究。

本发明所构建的多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC在研究蛋白质在体内(in vivo)互作，揭示蛋白质新功能等方面具有全新的应用价值。

本发明所述多功能植物双元质粒pPBEL-BiFC在免疫共沉淀Co-IP和BiFC检测过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：