[发明专利]塞尼卡谷病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针

说明书

本发明公开了一种用于检测塞尼卡谷病毒(SVV)的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针。本发明能对塞尼卡谷病毒实施快速检测，可为疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗提供依据，指导塞尼卡谷病毒疫苗生产。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对塞尼卡谷病毒的准确定量，将在塞尼卡谷病毒的检测及疫苗生产中发挥重要作用。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测，特别涉及一种用于对塞尼卡谷病毒进行定性、定量检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。

背景技术

塞尼卡谷病毒

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley Virus(SVV)或Seneca Virus A(SVA))是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Seneca Virus病毒属的典型代表，与心病毒属

(Cardio Virus)最接近，是主要发生于猪的一种传染病，其临诊特征为感染猪只鼻部和口腔形成溃疡、厌食、跛行，导致新生仔猪急性死亡。早期塞尼卡谷病例主要发生于育肥猪，鼻部、口部和蹄部的冠状带部可见水疱症状，但最近发现的一些塞尼卡谷阳性病例发生于新生仔猪，症状为腹泻，无水疱病变，这些病例主要是通过对血清、粪便和不同组织进行PCR检测发现的。

塞尼卡谷病毒基因组结构

塞尼卡谷病毒是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，无囊膜包被,直径约27nm，衣壳蛋白呈二十面体，基因组全长约7.2kb，包括5’端、3’端和一个开放阅读框(ORF)，基因组3’端的末端有短的poly(A)和一个非翻译序列(3’-UTR),开放阅读框包含L蛋白及结构蛋白的P1区和非结构蛋白的P2区和P3区，P1区编码4个结构蛋白(1A-1D)，P2和P3区编码7个非结构蛋白(2A-2C、3A-3D)，与口蹄疫病毒基因组结构相似。

塞尼卡谷病毒的流行情况和疫苗

2002年，美国马里兰州的一家公司在细胞培养基中偶然发现了塞尼卡谷病毒。塞尼卡谷病毒最初被认为是PER.C6细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪的胰酶或胎牛血清。在2007年之前，SVV主要作为溶瘤细胞被研究，可有效治疗一些神经内分泌肿瘤。到2007年，一批从加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡、蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为塞尼卡谷病毒阳性。

2014年11月，巴西也出现猪群感染塞尼卡谷病毒，发病母猪鼻部及蹄部有水泡及溃烂创面，感染仔猪(4日龄以内)出现神经症状并且死亡，死亡率达30％-70％。

2015年9月，美国某种猪场猪群出现跛足、水泡且伴随初生仔猪死亡，发病猪的血清、皮肤、粪便、蹄部冠状带的PCR检测结果显示为塞尼卡谷病毒阳性并通过猪睾丸细胞(ST细胞)分离得到塞尼卡谷病毒。

2015年3月，我国广东某猪场断奶猪出现鼻镜水泡，经送检水泡液、水泡皮、脚皮样品，检测结果显示猪口蹄疫、猪水疱病病原均阴性。经多种病毒检测及基因测序结果发现与塞尼卡谷病毒序列的相似性最高，确定发病猪群感染塞尼卡谷病毒，并分离到塞尼卡谷病毒。随后在2015年10月、11月及2016年1月、2月陆续在其它猪场发现猪群感染塞尼卡谷病毒病例。目前，如何用快速、简单的方法检测塞尼卡谷病毒是一些猪场急需解决的问题。

塞尼卡谷病毒抗体在猪、老鼠及牛身上均被检测到，目前尚未有报道证实塞尼卡谷病毒可感染人并引发临床症状。

疫苗是预防病毒的最有效措施，制备灭活疫苗是预防塞尼卡谷病毒流行的主要有效手段，灭活疫苗在传染病的预防中发挥这着重要作用，对病原进行了有效的灭活，可提供安全的疫苗，主要通过将塞尼卡谷病毒体外培养后、灭活，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。

塞尼卡谷病毒的检测