[发明专利]一种用于甲型流感病毒检测及H1和H3分型的多重RT-RPA引物组合及其应用

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种用于甲型流感病毒检测及H1和H3分型的多重RT‑RPA引物组合及其应用。本发明公开了一种用于甲型流感病毒检测及H1和H3分型的多重RT‑RPA引物组合，包括用于检测甲型流感病毒Matrix基因、H1亚型HA基因和H3亚型HA基因的RT‑RPA引物，其序列依次如SEQ ID NO.1至NO.6所示。所述多重RT‑RPA引物组合可用于对甲型流感病毒检测以及对H1和H3亚型进行鉴定。本发明系首次采用多重RT‑RPA方法来检测甲型流感病毒及并对H1和H3亚型进行鉴定，耗时短、灵敏度高、特异性强，能够快速有效地用于甲型流感病毒的检测和H1与H3分型。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及甲型流感病毒检测及其亚型分析方法，具体涉及一种用于甲型流感病毒检测及H1和H3分型的多重RT-RPA(逆转录重组酶聚合酶扩增技术)引物组合及其应用。

背景技术

流感病毒(Influenza virus)是常见的呼吸道感染性疾病的病原生物，具有极高发病率和致死率，因其传染性强、潜伏期短、致病性强、传播速度快等特点，极大地威胁着人类健康和生命。据不完全统计，全球每年季节性流感病毒的成人感染率为5～10％，婴幼儿为 20～30％，造成25至50万人死亡。在分类学上，流感病毒主要分为甲、乙和丙三类，三者均属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，为8节段、单股负链RNA病毒，其中由于甲型流感病毒(Influenza A virus)变异性强，从而多次造成大流行。根据甲型流感病毒表面糖蛋白，血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)，可将其分成多种亚型，其中季节性流感病毒H1N1和H3N2最为常见。

甲型流感病毒感染有时没有临床症状，有时可引起发热、咳嗽、咽喉痛、头痛等临床症状，与腺病毒、呼吸道合胞病毒等病原感染引起的症状相似，因此，很难根据临床症状对流感病毒感染进行准确鉴定。研究表明，与实验室检测相比，临床症状和体征的阳性预测值为18～87％，具有极大的不确定性。甲型流感病毒常用的实验室检测方法主要有分离培养、血清学和分子生物学技术等；采用鸡胚或犬肾传代细胞分离培养流感病毒，需要2～ 5天的时间，属于滞后性检测，对于就医病人，并不能提供及时有效的诊断。临床上，主要利用流感病毒快速诊断技术检测抗原或神经氨酸酶活性，虽然该技术可快速检测，但灵敏度较低，而且不能鉴定感染亚型。基于核酸的检测技术，目前广泛应用于检测甲型流感病毒，然而大多数方法是基于PCR技术，虽然PCR技术能够实现多靶标扩增和分型检测，但该方法的检测成本和技术要求较高，易污染，无法进行现场或即时检测。因此，急需一种能够即时、简便、准确的核酸检测方法，用于甲型流感病毒的检测及亚型分析。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种核酸等温扩增技术，借助重组酶与寡核苷酸形成核酸-蛋白复合物来扫描模板双链DNA，寻找同源序列，而后进行链交换，利用单链结合蛋白稳定单链DNA，阻止寡核苷酸由于迁移而排出，进而利用DNA聚合酶合成DNA。不同于PCR反应，RPA不需要核酸变性，最佳反应温度为37～41℃，也可在常温下进行，无需特殊设备，大大加快了反应速度，在10min内可将单个分子扩增到10¹²。另外，将RPA与反转录反应(reverse transcription，RT)结合，可对 RNA模板进行扩增。此外，RPA仅需一对引物即可完成扩增，可用于多重反应体系，同时扩增多个靶标基因。目前，RPA技术已被用于多种病原生物的快速检测；然而多重RPA技术应用于甲型流感病毒检测和分型，则未见报道。因此，基于甲型流感病毒基因序列分析，可设计特异性核酸引物，来构建甲型流感病毒多重RT-RPA扩增体系，实现甲型流感病毒快速检测及H1和H3分型，指导病人合理用药。

发明内容