[发明专利]用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒

说明书

本发明提供用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’‑CGTTCAGGAGAGCCACCG‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑GAACTGACCGATGACGTA‑3’；下游引物序列为5’‑GTCTCATTAAACGGCTCG‑3’。本发明还提供相应的实时荧光PCR试剂盒。本发明提供特异性引物和探针，通过提取阪崎肠杆菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中阪崎肠杆菌含量的目的，具有高灵敏度和高特异性，对判断阪崎肠杆菌活性菌的含量以至于后续研究泌尿道感染具有重要意义。

技术领域

本发明属于分子生物学和体外诊断试剂技术领域，具体涉及用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是肠杆菌科的一种，属革兰氏阴性、不会形成孢子而呈棒状的细菌，最适宜在37℃至43℃之间生长。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50％以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。传统的诊断阪崎肠杆菌的方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判定，不利于及时找到病原，诊断病因。PCR技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增DNA或RNA片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。Taq Man探针法检测特异性强，灵敏度高，方便优化反应条件，能够用于阪崎肠杆菌的快速检测。

发明内容

本发明目的在于设计一组阪崎肠杆菌特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于阪崎肠杆菌检测的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将阪崎肠杆菌16SrDNA基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有16SrDNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据阪崎肠杆菌16SrDNA基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

本发明的第一个目的是提供了用于检测阪崎肠杆菌的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’-CGTTCAGGAGAGCCACCG-3’；

所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：

上游引物序列为5’-GAACTGACCGATGACGTA-3’；

下游引物序列为5’-GTCTCATTAAACGGCTCG-3’。

作为优选，探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测阪崎肠杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的特异性引物和探针。

作为优选，在20μl PCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.2μl，所述下游引物的用量为0.2μl，所述探针的用量为0.2μl。

作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品和阳性对照；所述系列浓度标准品是将阪崎肠杆菌16SrDNA基因与载体连接，转化至感受态细胞中诱导表达，提取重组质粒，将重组质粒定量后稀释，得到系列浓度标准品。

作为优选，所述标准品的核苷酸序列为序列表中序列2。

本发明的第三个目的是提供上述特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的：

(1)定性或定量检测或辅助检测阪崎肠杆菌；