[发明专利]一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法

权利要求书

1.一种从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，从有机质含量20-30g/kg的土壤中提取并分离出芽孢杆菌类菌种；分离芽孢杆菌类菌种的固体选择培养基为尿素和硫酸镍；

步骤2，对步骤1分离出来的芽孢杆菌类菌种进行繁殖培养，采用分光光度计600nm波长测量得到芽孢杆菌类菌液的吸光度值为1.2-1.6；

步骤3，将步骤2得到的芽孢杆菌类菌液和胶凝液等体积混合，置于30℃恒温气浴培养箱中养护一段时间后，对混合液进行过滤，得到微生物诱导碳酸钙沉淀；所述胶凝液由尿素、醋酸钙和水组成，所述凝胶液中尿素的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L，醋酸钙的摩尔浓度为0.5-1.0mol/L。

2.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤1所述土壤采集自深度5-30cm内的土样，土样的保存方法为：放入灭菌的样品袋内密封保存于4℃冰箱内。

3.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤1所述提取并分离出芽孢杆菌类菌种的具体方法为：

a)称取土样5g，在超净工作台内将称量好的土样倒入90ml无菌水中，充分震荡使土样呈悬液状，置室温下静置4小时，即为10^-1稀释液；

b)用微量移液器取处理后的土壤上清液0.5ml于装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即为10^-2稀释液；吸取10^-2稀释液0.5ml，移入装有4.5ml无菌水中的试管内，振荡，让菌液混合均匀，即成10^-3稀释液；连续稀释，制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液；

c)用移液枪吸取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液各0.05ml，分别接种在相应编号的琼脂平板上；将涂布稀释液的平板平放于桌面上，静置10-20min使菌液渗透进培养基中，然后将培养基倒置，置于30℃恒温培养箱中培养24h；

d)在培养基中添加尿素和硫酸镍作为固体选择培养基，所述培养基中尿素的浓度为10-20g/L，硫酸镍的浓度为10-20g/L，并用涂布器在培养基表面涂布酚酞溶液，然后用接种丝蘸取培养后的菌种悬浊液在培养基表面划线接种，置30℃恒温培养箱中培养24h，最后取周围存在红色区域的菌斑作为下次纯化的菌株；如此反复纯化3次，最终得到纯化菌株。

4.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤2所述芽孢杆菌类菌种进行繁殖培养所选择的培养基包括以下重量份的组分：

酵母浸膏：5份；

蛋白胨：10份；

氯化钠：10份；

尿素：10份；

磷酸二氢钾：1.4份；

磷酸氢二钠：5.3份；

硫酸镁：0.2份；

葡萄糖粉：10份；

琼脂：15份；

水：1000份；

所述培养基的pH为7。

5.如权利要求1所述的从土壤中直接提取微生物菌种制备碳酸钙的方法，其特征在于，步骤3所述混合物在30℃恒温气浴培养箱中养护时间为5天以上。