[发明专利]用于鉴别穿山甲品种的DNA微型条形码引物对和数据库及其应用

权利要求书

1.一种穿山甲DNA微型条形码引物对，其特征在于，所述引物对为：

COIB-F：AACCTAGCACATGCAGGAGC；

COIB-R：TAGGAGTAATACGGCTGTAAC。

2.根据权利要求1所述的DNA微型条形码引物对，其特征在于：所述穿山甲的品种包括中华穿山甲、南非穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲、长尾穿山甲、大穿山甲、菲律宾穿山甲。

3.权利要求1所述的穿山甲DNA微型条形码引物对的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：从GENBANK中下载穿山甲属物种、以及甲片常见伪品的原动物的COI基因序列，进行序列比较，设计微型鉴别引物COIB-F和COIB-R后合成。

4.根据权利要求3的DNA微型条形码引物对的设计方法，其特征在于：所述序列比较为使用MEGA 5.0，人工选取基因片段；所述设计微型鉴别引物为使用软件Primer Premie 5.0进行设计的。

5.一种穿山甲DNA微型条形码数据库，其特征在于：其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1-7示。

6.一种穿山甲DNA微型条形码数据库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测物种的DNA；

(2)用穿山甲DNA微型条形码引物对对待测物种的DNA进行PCR扩增；

所述穿山甲DNA微型条形码引物对为：

COIB-F：AACCTAGCACATGCAGGAGC；

COIB-R：TAGGAGTAATACGGCTGTAAC；

(3)PCR扩增产物的检测、测序与人工修正。

7.根据权利要求6所述的DNA微型条形码数据库的构建方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述待测物种DNA的提取采用改良SDS法，包括以下步骤：

①用无水乙醇浸泡穿山甲甲片12h，每隔3h更换一次无水乙醇，期间在振荡器上轻微震荡清洗；浸泡完毕后，用去离子水做同样的操作；在60℃下烘干，在紫外灯下正反面分别照射灭菌30min，制成粉末状；所述制成粉末状为采用已灭菌的剪刀剪至细末或者用液氮在研钵中研磨成粉末；

②取0.4g甲片粉末置于1.5mL离心管中，加入1mL浸泡液(10mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L EDTA、50mmol/L NaCl、PH8.0)于4℃放置过夜，5000rpm离心10min后弃上清液；

③加入1mL含有0.1％胶原酶和1％胰蛋白酶的PBS液在37℃处理24h，充分震荡，10000rpm高速离心10min后弃上清液；

④向沉淀中加入1mL含有10mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、2％SDS、1mmol/L DTT、1mmol/L CaCl₂和100μL蛋白酶K(10g/L)的消化液，55℃水浴消化，期间每4h轻轻震荡混匀一次，10000rpm离心10min取上清；所述55℃水浴消化时间为72h或者120h；

⑤以平衡酚进行DNA抽提；以氯仿：异戊醇(24:1)混合液进行DNA抽提；

⑥以无水乙醇进行沉淀；

⑦以75％冰乙醇进行漂洗；

⑧干燥所得DNA，并以TE溶解DNA；

步骤(2)中，以步骤(1)所得DNA为模板，利用COIB-F和COIB-R引物对，进行PCR扩增，PCR反应具体条件如下：

PCR反应体系为25μL：ddH₂O 9.5μL，2.5μmol/L的正反引物各1.0μL，2xTaq PCR Mix12.5μL，模板DNA 1.0μL；

PCR扩增程序为：94℃预变性10min；94℃变性30s，55℃复性45s，72℃延伸30s(35个循环)；70℃补齐10min。