[发明专利]一种传染性脾肾坏死病毒ORF074基因缺失株及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种传染性脾肾坏死病毒ORF074基因缺失株及其制备方法和应用，为传染性脾肾坏死病毒株缺失ORF074基因后制成的减毒病毒株。本发明还提供了一种带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF074基因缺失株及其制备方法和应用，为传染性脾肾坏死病毒缺失了ORF074基因，且在基因缺失的部位通过同源重组插入筛选标记基因后制成的减毒病毒株。本发明提供的传染性脾肾坏死病毒ORF074基因缺失株是一种敲除了ORF074基因的重组基因工程疫苗，毒力较弱，大大降低被免疫的鱼类发病致死率，采用浸泡免疫即可达到显著的免疫效果，无须注射，应用价值极大。

技术领域

本发明涉及水产养殖疾病防控领域，具体涉及一种传染性脾肾坏死病毒ORF074基因缺失株及其制备方法和应用。

背景技术

鳜，又名桂花鱼，因其生长快、品质优良和味道鲜美等优点成为我国主要淡水名特优养殖鱼类之一。由传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosisvirus, ISKNV)引起的鳜虹彩病毒病是鳜养殖的主要疫病, 导致鳜死亡率接近100%, 成为制约鳜养殖业发展的主要瓶颈。

传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是肿大病毒属的代表种，其全基因的组核酸序列已经测定，全长为111362bp，G+C含量在54.78%，包含124个潜在的开放阅读框（ORF），编码长度从40到1208个氨基酸。通过序列分析，目前推测出ORF006L为主衣壳蛋白；ORF19R、ORF46L、ORF27L和ORF63L与DNA复制、修饰和加工有关；ORF24、ORF28L、ORF34R、ORF64L及ORF87R与转录和核苷酸代谢有关；ORF111L和ORF048R与宿主相互作用有关；ORF12、ORF65、ORF66、ORF99和ORF111L编码环指蛋白。

目前用于预防控制传染性脾肾坏死病毒的ISKNV疫苗主要为细胞灭活疫苗，细胞灭活疫苗具有安全性好、免疫原性强、保护率高、研发周期短等优点，成为最常用的疫苗种类，但灭活疫苗只能引起体液免疫，免疫应答类型较单一，免疫维持时间较短，需要多次接种且接种量大等缺点。现在许多文献已经报道了基因缺失减毒活疫苗可以有效、安全地起到保护的效果，减毒活疫苗可诱发体液免疫和细胞免疫，免疫应答类型较全面，免疫维持时间较长，接种次数少且接种量小等优点成为目前ISKNV疫苗的研究新热点。而以ISKNVORF074基因缺失株作为基因缺失减毒活疫苗的研究未有报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种免疫效果好、使用便捷、应用性强、无须注射的传染性脾肾坏死病毒疫苗及其制备方法和应用。在野生性传染性脾肾坏死病毒的基因组中敲除了ORF074基因，构建了ORF074基因缺失病毒（ISKNV△ORF074）。相比传统疫苗的免疫方式，浸泡免疫是基因缺失疫苗的最大优势，这是鱼类病毒性疫苗免疫方式的重大创新，具有广阔的应用空间。

本发明第一方面提供了一种传染性脾肾坏死病毒ORF074基因缺失株，为传染性脾肾坏死病毒株缺失ORF074基因后制成的减毒病毒株。

优选地，所述ORF074基因序列为与SEQ ID NO：1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供了一种带筛选标记的传染性脾肾坏死病毒ORF074基因缺失株，为传染性脾肾坏死病毒缺失了ORF074基因，且在基因缺失的部位通过同源重组分别插入第一筛选基因和第二筛选基因后制成的减毒病毒株。

优选地，所述ORF074基因序列为与SEQ ID NO.1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

优选地，所述第一筛选基因和第二筛选基因不同，且分别独立地选自插入红色荧光蛋白基因以及抗性筛选基因。

进一步优选地，所述红色荧光蛋白基因为DsRed2蛋白基因。