[发明专利]L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D-阿洛酮糖中的应用

说明书

本发明公开了L‑鼠李树胶糖‑1‑磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D‑阿洛酮糖中的应用，其基因序列为由SEQ ID NO.1编码的野生型L‑鼠李树胶糖‑1‑磷酸醛缩酶分别经过其氨基酸第29、188、266或152位饱和定点突变。本发明克服了野生型RhaD产生D‑阿洛酮糖:D‑山梨糖＝1：1没有立体选择性的缺陷，使得催化反应仅产生D‑阿洛酮糖或以D‑阿洛酮糖为主，且经过突变的RhaD的酶活较高。本发明方法制备的定点突变的RhaD制备D‑阿洛酮糖，合成效率高、工艺简单、节约成本、D‑阿洛酮糖催化效率最高达到100％，利用本发明方法实现了工业化RhaD催化D‑甘油醛大量合成D‑阿洛酮糖。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖D-阿洛酮糖中的应用。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-psicose)属于一种稀有单糖，作为一种零能量、不被消化的食用糖替代品.由于D-阿洛酮糖具有零热量，难以被肠道消化吸收等特性，被美国食品导航网评价为最具潜力的蔗糖替代品，现多被引用为新型低卡路里甜味剂。同时，D-阿洛酮糖也可以作为肝脂类酶和肠道α-糖苷酶的抑制剂，减少脂肪堆积。诸多研究结果显示D-阿洛酮糖通过抑制睾丸组织中ROS的产生，阻止邻苯二甲酸二(2-乙基)乙酯诱导的睾丸损伤。此外D-阿洛酮糖除了对6-羟基多巴胺诱导的细胞凋亡有神经保护的作用外，还能抑制高浓度葡萄糖诱导下的单核细胞趋化蛋白MCP-1的表达。基于D-阿洛酮糖众多的生理功能，在未来食品、医药和化妆品等领域的应用将会非常广泛。

D-阿洛酮糖功能活性与人类健康密切相关，建立完善的D-阿洛酮糖的高产体系迫在眉睫。目前D-阿洛酮糖的研究，瓶颈主要集中在如何扩大产业化生产。早期D-阿洛酮糖的合成方法是化学转化，其合成过程不仅繁琐还存在一定的局限性，更不符合当今绿色可持续发展的社会理念。目前生产D-阿洛酮糖主要是利用酶固定转化法，即对酶的克隆表达以及产物的分离精制。不论是化学合成法还是生物转化法制备D-阿洛酮糖，都存在一个大难题，产品分离与精制十分困难。粗产品中的D-阿洛酮糖往往与其他糖混合在一起，不仅产率降低，而且D-阿洛酮糖与其混杂的糖理化性质几乎完全相同，所以很难精制与提纯。为了对当前的D-阿洛酮糖合成体系进行优化，就必须解决这一难题。

前期研究表明属于磷酸二羟基丙酮(DHAP)依赖型醛缩酶家族的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(以下简称为RhaD)在以D-甘油醛为醛受体时，失去了对该醛受体的立体选择性，野生型生成D-阿洛酮糖和D-山梨糖两种稀有糖，两者比例接近于1：1。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明的其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶，其中：所述定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶由基因序列为由SEQ IDNO.1编码的野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶分别经过其氨基酸第29、188、266或152位饱和定点突变而产生的突变体。

作为本发明所述定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的一种优选方案，其中：所述其氨基酸第29、188、266或152位饱和定点突变而产生的突变体，包括L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的突变体Y152A、突变体N29K、突变体P188C、突变体P188T、突变体P188F、突变体N29I。

作为本发明所述定点突变的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶的一种优选方案，其中：所述由SEQ ID NO.1编码的野生型L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶来源于大肠杆菌MG1655菌株。