[发明专利]一株氮哌酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明公开了一株氮哌酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明制备了氮哌酮完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，得到一株产生氮哌酮抗体的杂交瘤细胞株CGMCC No.14694。此细胞株分泌的单克隆抗体，对氮哌酮具有较好的特异性和检测灵敏度(IC₅₀值为0.5ng/mL)。本发明成果可用于建立动物性组织中氮哌酮残留的免疫检测方法，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及一株氮哌酮单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术

氮哌酮(又称阿扎哌隆，Azaperone，简称Azap)是一种丁酰苯类神经安定药。动物经肌肉注射此药后可消除紧张感，活动力下降，对环境淡漠并长期处于安静状态，有助于避免动物因“聚居应激”和在混群时发生互相攻击和打斗的现象，降低因应激及创伤引起的死亡率，因此在长途运输中常常给猪等动物使用该药。我国动物性食品中最高残留限量标准规定猪的肌肉、皮和脂肪、肝、肾中氮哌酮的最大残留限量值(MRL)分别为60mg/kg，60mg/kg，100mg/kg，100mg/kg。因此，建立快速有效的检测氮哌酮含量的方法具有重要意义及市场价值。

酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，然而得到高亲和力和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。有关氮哌酮的残留检测方法报道文献较少，因此建立快速简便的氮哌酮检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

发明内容

本发明的目的首先是提供一株氮哌酮单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2017年9月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14694，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。由该细胞株制备的抗体对氮哌酮具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立氮哌酮的免疫学检测方法。

本发明的第二个目的在于提供一种氮哌酮单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.14694的氮哌酮单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌产生。

所述氮哌酮单克隆抗体的应用，用于动物性组织中氮哌酮残留的分析检测。

本发明的第三个目的在于提供制备所述氮哌酮免疫原的方法，主要包括以下步骤：

1)合成半抗原Azap：将4-苯丁酸甲酯，4-氯丁酰氯，和氯化铝，加入二硫化碳中，升温至室温并搅拌过夜；向反应液中加冰水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得黄色油状中间产物2；

将中间产物2，碘化钾，碳酸钾，加入乙腈溶液中，加入1-(2-吡啶基)哌嗪，反应液升温至70℃过夜；向反应液中加冰水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩；经硅胶柱纯化得到黄色油状中间产物3；

将中间产物3，氢氧化锂，加入四氢呋喃和水；反应液升温至室温，搅拌过夜；用盐酸酸化至pH为6，饱和食盐水水洗一次，无水硫酸钠干燥，浓缩得白色固体，制备得半抗原Azap；

2)完全抗原的制备：

免疫原Azap-KLH的制备：称取半抗原Azap，1-乙基碳二亚胺盐酸盐，以及N-羟基琥珀酰亚胺，用无水N,N-二甲基甲酰胺溶解得到A液；取钥孔血蓝蛋白KLH，用硼酸缓冲溶液溶解得到B液，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物Azap-KLH混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原Azap-KLH。

本发明的第四个目的在于提供制备所述氮哌酮单克隆抗体杂交瘤细胞株的方法，主要包括以下步骤：