[发明专利]在中空纤维生物反应器中扩增干细胞

说明书

本发明涉及使用中空纤维生物反应器技术产生大量细胞。所述细胞是非胚胎干细胞、非生殖细胞，其具有以下一个或多个特征：无需转化而在培养中长期复制、长期复制的标志物例如端粒末端转移酶、多能性标志物和广泛的分化潜能。

本申请是申请日为2012年6月6日，申请号为201280038305.0，发明名称为“在中空纤维生物反应器中扩增干细胞”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及使用中空纤维连续灌注生物反应器技术产生大量细胞。所述细胞是非胚胎干细胞、非生殖细胞，其可以通过以下一项或多项进行表征：无需转化而在培养中长期复制、长期复制的标志物例如端粒末端转移酶、多能性标志物和广泛的分化潜能。

背景技术

中空纤维生物反应器技术已用于实现细胞的高密度扩增。通常，细胞在许多中空纤维内和/或外扩增。由于这类设计提供的大表面面积，使用所述纤维作为培养基质能够产生大量的细胞，尤其是用于临床应用的细胞。这种技术，首先由Knazek在20世纪70年代开发，已经经历很多的发展和改进。基本概念是提供可透过营养物、气体和其他基础培养基成分以及细胞废物、但不能透过细胞并且所述细胞可在其上扩增的纤维基体。

在半渗透性的管状膜上的细胞培养最初由Knazek在20世纪70年代早期发明。见，例如，U.S.3,821,087；3,883,393；4,220,725；4,184,922；和4,200,689。根据所述发明，使悬浮于营养培养基中的细胞停留在毛细管的外表面，所述毛细管被流经所述毛细管的充氧营养培养基连续灌注。营养物质从所述灌注培养基扩散穿过所述毛细管壁并进入细胞中，而细胞废物从所述细胞扩散穿过所述毛细管壁进入所述灌注液，可从所述灌注液中回收那些产物。

作为对失败的尝试将细胞培养成密度和/或结构接近活组织的那些细胞的反应，开发了所述技术。主要地，在培养活细胞至非常高的密度例如至组织中的密度方面存在问题。第一，当细胞层的厚度增加时，培养基组分必须扩散穿过所述细胞层以到达所有细胞。第二，在细胞培养期间必须维持适当的微环境。因此，紧密靠近生长的细胞的流体随着细胞代谢的进行而不断地改变，并只有当更换或搅动所述培养基时以逐步的方式恢复至其最初的状态。第三，需要在其上培养所述密集细胞的晶格或合适的材料。Knazek的发明通过在细胞群中提供供应大的和小的必需分子的营养物源；在细胞群中的除去代谢产物的槽；合适的微环境；允许以三维生长的晶格；以及大的单层和/或多层细胞培养的表面面积(相对于标准细胞培养技术所需要的体积)，而解决了这些问题。

自所述最初的发明以来，已经成功地使用这项技术来扩增多种细胞类型，并且有很多涉及对该基本技术的各种改进的科学和专利文献。这些改进已经进行了多种技术修改，以最优该技术的使用以达到Knazek的最初目标。在工业中，这项技术已经被命名为“中空纤维”细胞培养并且，在生物反应器装置中，提供了中空纤维生物反应器细胞培养。见，例如，美国专利3,997,396；4,184,922；4,200,689；4,220,725；4,804,628；4,999,298；5,126,238；5,162,225；5,627,070；5,656,421；5,712,154；6,001,585；6,680,166；6,911,201；6,933,144；7,534,609；美国公开文本2001/0044413；2003/0224510；2005/0032218；2005/0003530；2006/0205071；2007/0298497；2008/0206733；2008/0213894；2008/0220522；2008/0220523；2008/0227190；2008/248572；2008/254533；2009/0191631；2009/0196901；2010/0042260；2010/0144037；2010/0209403；2010/0233130；2010/0267134；WO 91/18972；WO 95/13088；WO 95/21911；WO 01/23520；WO 07/012144；WO 10/034468；WO 10/149597；和Gloeckner等,Biotech Prog 17:828-31(2001)。