[发明专利]具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法

说明书

本发明涉及一种具有粘附‑抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法，将理性设计的融合蛋白基因克隆到质粒载体得到重组表达质粒，进一步转化宿主细胞后用诱导剂诱导宿主细胞过量表达融合蛋白，分离纯化后得到融合蛋白。所述贻贝粘附蛋白包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列。所述两性离子多肽包含SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示序列。实现了微生物一步法合成粘附‑抗污双功能融合蛋白，该过程温和高效，成本低廉，设备要求度低，易于后期扩大生产。

技术领域

本发明涉及一种具有粘附-抗污双功能的贻贝粘附蛋白/两性离子多肽融合蛋白及合成方法，同时还涉及所述融合蛋白的基因设计、含有融合蛋白基因片段的重组表达载体的构建、在大肠杆菌中的发酵表达、融合蛋白的分离纯化方法以及对基质材料进行表面修饰的应用。

背景技术

生物污损(biofouling)是细菌等生命物质在基质材料表面附着并繁殖导致器材损耗的过程。在医药、航海、建筑、食品等众多领域中，生物污损不仅导致了材料的耗损，还引起了工业能耗和医疗安全等问题，如在人工心脏瓣膜和血管支架等移植材料接触血液组织时，在极短的时间内，非特异性蛋白吸附就会发生在移植物表面，之后引发一系列生物学级联反应，将极大可能地引发排异反应。抗污材料的开发和表面接枝技术的发展是解决生物污损的有效方法。

聚乙二醇(PEG)是聚醚类分子，其多羟基结构能形成水合层，曾经一度作为抗蛋白吸附材料的黄金标准。但是在氧气和过渡金属离子存在时，尤其是在较高温度下或体内酶存在条件下，PEG会发生降解。因此，近些年中，取代PEG的抗蛋白吸附材料备受关注。两性离子材料如羧酸甜菜碱(CB)和磺基甜菜碱(SB)，其分子结构中同时含有阳离子基团和阴离子基团，分子整体呈中性。分子中的极性基团使两性离子材料具有超亲水特性，在水溶液环境中材料表面能形成水合层抵抗蛋白非特异性吸附，而且稳定性好，这些特性使两性离子材料成为近些年的研究热点[Zhang L,Cao Z,Bai T,et al.Zwitterionic hydrogelsimplanted in mice resist the foreign-body reaction[J].Nature Biotechnology,2013,31(6):553]。其中氨基酸作为天然的两性离子，带有正电荷的赖氨酸(K)和带有负电荷的谷氨酸(E)形成的电中性两性离子多肽单分子层具有高效的抗蛋白吸附能力，生物多肽独特的生物相容性使其有望成为有广阔应用前景的抗污材料[Chen S,Cao Z,JiangS.Ultra-low fouling peptide surfaces derived from natural amino acids.[J].Biomaterials,2009,30(29):5892-5896]。

在表面接枝技术研究方面，可以调控性实现材料表面修饰的方法主要有表面的原子转移自由基聚合法、光引发活性接枝聚合法和点击化学表明接枝法等。这些方法涉及的反应不同，应用条件单一，合成步骤繁琐，如接枝反应前需对材料表面进行等离子体、UV和γ射线诱发，臭氧表面活化等预处理过程，对基体材料特异性较强[Liu Y,Zhang S,WangG.The preparation of antifouling ultrafiltration membrane by surface graftingzwitterionic polymer onto poly(arylene ether sulfone)containing hydroxylgroups membrane[J].Desalination,2013,316(2):127-136]。因此急需开发一种简单、普适性、温和高效的表面接枝方法。近年来，通过对自然界中生物粘附现象的观察和机理分析，尤其是基于海洋贻贝粘附蛋白的研究，开发具有广泛底物粘附性的表面接枝技术已成为研究和应用的亮点。