[发明专利]一种利用水稻真核表达系统制备lunasin多肽的方法及应用

说明书

本发明公开了一种利用水稻真核表达系统制备lunasin多肽的方法及应用，该方法包括以下步骤：(1)大豆lunasin基因克隆和植物表达载体构建，克隆大豆lunasin基因，构建pCAMBIA2301 35s‑lunasin植物表达载体；(2)利用农杆菌介导的水稻遗传转化技术将lunasin基因片段转入水稻基因组，并进行分子检测；以及(3)提取转基因水稻蛋白，分离纯化lunasin多肽。申请中首次将lunasin转入水稻的基因组中，通过检测lunasin在水稻中的含量及其生物活性，验证外源lunasin可在水稻中成功表达，并且具有生物活性，包括抗氧化性、抗炎活性，以期将其开发成为功能性食品。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种利用水稻真核表达系统制备lunasin多肽的方法及应用。

背景技术

lunasin，是一种新型天然多肽，含有43个氨基酸，最初在大豆中被发现，之后被发现也存在于大麦、小麦和龙葵等植物中。研究表明lunasin具有多种生理活性，包括抗氧化、抗高血压、抗炎、抗癌、降胆固醇、抗肥胖及免疫调节等。由于其巨大的应用价值，越来越多的科学家开始关注如何利用更加高效的方法来生产lunasin。

目前，基因工程发展迅速，利用基因工程和植物遗传转化的手段，将lunasin基因片段转入植物基因组中，利用植物的真核表达系统来生产lunasin已成为一种有效的手段。水稻作为我国一种主要的粮食作物，其遗传转化体系已经非常成熟。

目前，国内尚没有关于如何利用基因工程方法，将lunasin基因片段克隆转载到水稻中，经过水稻的真核表达系统来生产lunasin的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用水稻真核表达系统制备lunasin多肽的方法及应用，利用基因工程方法，将基因片段克隆转入到水稻基因组中，利用水稻的真核表达系统，使其得以表达并具备较高的生理活性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种利用水稻真核表达系统制备lunasin多肽的方法，包括以下步骤：

(1)大豆lunasin基因克隆和植物表达载体构建，克隆大豆lunasin基因，构建pCAMBIA2301 35s-lunasin植物表达载体；

(2)利用农杆菌介导的水稻遗传转化技术将lunasin基因片段转入水稻基因组，并进行分子检测；以及

(3)提取转基因水稻蛋白，分离纯化lunasin多肽。

优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)包括：

(11)利用植物组织RNA提取试剂盒提取大豆新鲜组织RNA，反转录为cDNA(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix kit)，进行PCR扩增，克隆lunasin基因片段；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下预期大小的目的片段，纯化、回收，连接T载体；

(12)用SacI和KnpI分别双酶切pCAMBIA2301和pEASY-T1-lunasin；分别回收pCAMBIA2301大片段和pEASY-T1-lunasin小片段；将回收的两片段连接，在PCR管中完成连接反应，16℃水浴，连接过夜；连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；对重组子进行酶切验证后测序。

优选地，上述技术方案中，所述步骤(11)中的PCR扩增以cDNA为模板，以带有SacI和KnpI接头的Iun-F:CGAGCTCATGTCCAAATGGCAGCACCAGC和Iun-R:GGGGTACCTCAGTCGTCGTCATCATCATC为上下游引物。