[发明专利]LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用

说明书

本发明公开了LbCpf1‑RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用。本发明以OsPDS基因和OsSBEIIb基因为靶基因，构建了靶向一个基因的双位点和两个基因的系列载体，并利用农杆菌转化方法将载体导入水稻愈伤中，利用LbCpf1‑RR突变体成功获得了目的基因敲除的水稻植株。LbCpf1‑RR突变体与蛋白质LbCpf1的唯一不同在于：第532位的氨基酸由G变为R，第595位的氨基酸由K变为R。本发明提供的LbCpf1‑RR突变体由于扩充了其识别的PAM位点序列，所以扩大了CRISPR/Cpf1系统在水稻基因组中的编辑范围，对于推进此系统在植物基因组编辑领域中的应用有重要意义。本发明具有重大的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经成为分子生物学中最强大的工具之一，且被广泛应用于植物和农作物功能基因改良。CRISPR/Cas9系统首次在细菌中发现，由sgRNA和Cas9蛋白两部分组成(Jinek et al.，2012)。Cas9蛋白通过自身的核酸内切酶活性，对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，从而引起靶位点基因组DNA序列双链断裂(double-strand breaks，DSBs)，然后通过非同源末端连接(non-homologous endjoining，NHEJ)或同源重组介导的修复(homology-directed repair，HDR)两种方式引入突变。目前，常用的Cas9蛋白为SpCas9及其各种突变体，识别的PAM序列分别为“NGG”、“NGA”或“NGCG”。

CRISPR/Cpf1系统和CRISPR/Cas9系统同属Ⅱ类CRISPR系统，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。CRISPR/Cpf1系统一经建立便被应用于人类与动物细胞系及水稻、烟草、大豆、拟南芥等不同植物基因组的定点敲除和功能分析研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株(Endo et al.，2016；Hu et al.，2016；Kim et al.，2017；Tang et al.，2017；Wanget al.，2017；Xu et al.，2017)。CRISPR/Cpf1系统由crRNA和Cpf1蛋白两部分组成，Cpf1蛋白对“TTTN”的PAM位点进行识别，在crRNA的引导下对基因组DNA的靶位点进行切割(Zetsche et al.，2015)。与CRISPR/Cas9系统相比，CRISPR/Cpf1系统有如下优势：Cpf1只需单个RNA，即crRNA(CRISPR RNA)，crRNA长度为43nt，且切割无需tracrRNA的帮助，因而组装更加简单；因其识别的PAM位点为“TTTN”，因此可识别富含AT的5’和3’UTR区域；一次可对多种靶位点进行编辑，实现简单的基因多重编辑，同时具有更高的编辑效率和较低的脱靶效应。但识别的PAM位点序列的限制，不利于CRISPR/Cpf1的更为广泛的应用。最近一项在人类细胞中的研究表明，通过对Cpf1蛋白进行突变，改变其识别的PAM位点序列，从而克服了PAM位点的限制(Gao et al.,2017)，但是突变的Cpf1蛋白在植物中是否仍具有核酸酶活性，需要进一步研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何扩大CRISPR/Cpf1系统在植物基因组中的编辑范围。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种表达盒甲。所述表达盒甲中由启动子甲启动LbCpf1-RR突变体的编码基因表达。

所述LbCpf1-RR突变体可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列4自N端起第41至1267位所示的蛋白质；

a2)在a1)所示蛋白质的N末端添加一个甲硫氨酸残基，得到的蛋白质；