[发明专利]一种溶酶体超分辨荧光成像染料及其合成方法和应用

说明书

本发明提供一种溶酶体超分辨荧光成像染料及其合成方法和应用，该染料具体分子结构为3‑乙酰氨基取代的罗丹明乙基吗啡啉酰胺，其结构式如下式(1)所示，本发明的溶酶体超分辨荧光成像染料不仅具有耐酸的性能，并且保留了光激活性能。因此这类耐酸性光激活的染料可以在应用于溶酶体中超分辨成像技术时可以不受生物环境的pH干扰，从而达到良好的成像效果。此外，本发明中的溶酶体超分辨荧光成像染料还可以作为分子荧光探针应用于传感及检测领域。

技术领域

本发明属于荧光染料和超分辨荧光成像领域，具体涉及一种溶酶体超分辨荧光成像染料及其合成方法和应用。

背景技术

溶酶体作为真核细胞中一个重要的酸性细胞器，包含超过60种的酸性水解酶、组织蛋白酶，及各类特异性的膜蛋白。它不仅具有胞内消化的功能,一些情况下也具有调节分泌功能.当溶酶体由于自身变异或外界影响而导致其数量、分布等发生异常时，可能会造成肺部疾病(矽肺、肺结核等)、溶酶体贮积症(台-萨氏综合征、Ⅱ型糖原累积病、细胞内含物病等)以及肿瘤等各类病症。溶酶体作为细胞内的“消化器官”，其相关的研究一直是生命科学的热点。

荧光成像技术是研究溶酶体在生命活动中所扮演角色的重要工具，传统共聚焦成像因无法突破光学衍射极限，其成像分辨率仅为200纳米，无法满足单分子成像的需求。所幸的是近年来发展的一系列超分辨率成像技术，例如随机光学重构显微技术(STORM或dSTORM)使光学显微镜的空间分辨达到了前所未有的高度，其空间分辨率可达到20纳米。但是超分辨显微成像技术仍然面临诸多技术问题，其中之一的技术问题就是荧光染料的性能不够完美。基于单分子定位的超分辨显微成像技术需要染料不仅满足光稳定性好和荧光亮度高的优点，还需要其具有光致荧光“开-关”功能，这样才能够实现单分子的检测及定位。因此开发高荧光强度和光稳定性，具有光致荧光开关功能的新型荧光染料是超分辨荧光成像的迫切需求和当前热点。

开发生物成像用单分子定位超分辨荧光染料，目前最好的方法是在高荧光强度和光稳定性的染料中引入光开关功能。罗丹明类染料由于其突出的光性能，是目前超分辨中用的最多的一类染料。罗丹明染料的荧光“明-暗”状态是基于酰胺螺环开关，罗丹明螺酰胺在紫外光辐照下，会由不发光的闭环结构变为强荧光发射的开环结构。但在酸性条件下，氢离子的进攻同样会造成酰胺螺环开环从而发出荧光。因而当罗丹明螺酰胺染料暴露于溶酶体内偏酸性的环境中，其酸激活产生的荧光会严重干扰甚至导致光激活性能完全失效，这一特点大大限制了罗丹明螺酰胺染料在定位溶酶体的超分辨成像上的应用。因此开发耐酸性同时可以定位溶酶体的罗丹明螺酰胺类荧光开关染料对于了解溶酶体在生命活动中的意义显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明提供了一种溶酶体超分辨荧光成像染料及其合成方法和应用，研究发现这类染料在体内和体外的酸性环境下化学稳定，可以用于溶酶体超分辨成像中。

本发明所述一种的溶酶体超分辨荧光成像染料，其结构式如下所示：

同时，本发明还提供了所述一种溶酶体超分辨荧光成像染料的合成方法，合成路线如下：

具体步骤为：

(1)将3-硝基罗丹明和2-乙氨基吗啉按物质的量比(1:1-5)溶解于无水乙醇中，升温至回流，搅拌3～8小时后蒸除溶剂得到无色固体，进一步通过硅胶柱色谱分离，提纯后得到3-硝基罗丹明乙基吗啡啉酰胺。

(2)取上述步骤(1)中产物3-硝基罗丹明乙基吗啡啉酰胺，溶于适量甲醇中，在氢气氛围及钯碳(5～30％wt)催化下搅拌1～3小时，抽滤取滤液，减压蒸除溶剂后，经硅胶柱色谱分离提纯得到3-氨基罗丹明乙基吗啡啉酰胺。

(3)取上述步骤(2)中产物3-氨基罗丹明乙基吗啡啉酰胺产物与乙酰氯按一定物质的量比例(1:1-10)混合于无水二氯甲烷中，室温搅拌反应过夜，减压蒸除溶剂后，通过硅胶柱色谱分离提纯，得到3-乙酰氨基罗丹明乙基吗啡啉酰胺。