[发明专利]一种耐酸性光控荧光分子开关及其合成方法和应用

说明书

本发明提供一种耐酸性光控荧光分子开关及其合成方法和应用，该光控荧光分子开关化学结构特征如下：荧光团母体是罗丹明类染料，罗丹明发色团母体存在不同的取代基R¹、R²、R³、R⁴、X、Y，内酰胺的邻位存在伯胺或仲胺取代基，具体结构如式(1)所示。该耐酸光控荧光分子开关作为荧光探针在超分辨荧光成像、传感及检测中的应用。本发明耐酸性光控荧光分子开关开发的3‑伯胺或仲胺取代罗丹明螺酰胺不仅具有耐酸的性能，而且保留了光控分子开关性能因此这类耐酸性光控荧光分子开关可以应用于基于单分子定位的超分辨成像技术中，且不受生物环境中pH的干扰。此外，本发明中的耐酸光控荧光分子开关还可以作为分子荧光探针应用于传感及检测领域。

技术领域

本发明属于分子开关领域，具体涉及一种耐酸性光控荧光分子开关及其合成方法和应用。

背景技术

近年来发展出一系列超高分辨率荧光成像技术，其中基于单分子定位的光激活定位显微技术(PLAM)和随机光学重构显微技术(STORM或dSTORM)使光学显微镜的空间分辨达到了前所未有的高度(20nm)。目前超分辨显微成像技术已经被广泛应用到生命科学研究中，然而尽管超分辨显微成像技术取得了巨大的进步，将荧光显微镜的空间分辨率推进到了20纳米，但是超分辨荧光显微成像技术仍然面临诸多技术问题，其中之一就是所必需的荧光染料性能亟需改善。基于单分子定位的超分辨显微成像技术需要荧光染料不仅满足光稳定性好和荧光亮度高的需要，还要具有光控荧光分子“开-关”功能，这样才能够实现单分子的定位和检测。因此开发高荧光强度和光稳定性，具有光控荧光分子开关性能的新型荧光染料是超分辨荧光成像的迫切需求和当前热点。

开发生物成像用单分子定位超分辨荧光染料，目前最好的方法是在高荧光强度和光稳定性的染料中引入光控分子开关。罗丹明类染料由于其突出的光性能，是目前超分辨中用的最多的一类染料。罗丹明染料的荧光分子开关“明-暗”状态是基于酰胺螺环的光控开关，即传统罗丹明螺酰胺在紫外光辐照下，会由不发光的闭环结构变为强荧光发射的开环结构。S.W.Hell等人最早利用这一独特的光控分子开关将罗丹明螺酰胺标记在固定的PtK2细胞的微丝骨架上，利用单分子定位技术实现了超分辨成像。但是，包括罗丹明螺酰胺在内，光控开关分子在细胞内应用所面临的共同难题是需要紫外光作为“开-关”激活光，例如罗丹明螺酰胺需要用波长小于375nm的光来将闭环结构打开变为有荧光的开环结构，而紫外光会对细胞产生严重的光毒性，难以在活细胞中应用。为了改善激活光波长，W.E.Moerner等人将酰胺取代基修饰为较大的共轭体系，将吸收波长向长波长移动，首次将开关激发光延长到可见光区(400nm)，实现了对细菌表面的三维超分辨荧光成像。由此，罗丹明螺酰胺在超分辨成像中表现出巨大潜力。

罗丹明螺酰胺实现了用可见光控制荧光分子“开-关”，这对于生物成像来说极其重要和有意义，但是这类分子依然存在一个严重缺点限制其在超分辨成像中的普遍应用，那就是罗丹明螺酰胺这种分子开关除了可以光控之外，还可以由酸碱来控制，即在酸性条件下，罗丹明酰胺螺环打开变成可发光的开环结构。而细胞内存在许多偏酸性的环境(如溶酶体，蛋白的酸性位点等)，当罗丹明螺酰胺染料应用在这些酸性环境中，其酸控制的开关会严重干扰甚至导致光控分子开关性能完全失效，因此在酸性环境中基于这类染料的荧光探针目前无法应用于超分辨荧光成像。综上所述，开发耐酸性同时具有可见光控制的的罗丹明螺酰胺类荧光分子开关对于活细胞超分辨荧光成像显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明提供了一种耐酸性光控荧光分子开关及其合成方法和应用，该分子开关是以3-伯胺或仲胺取代罗丹明螺酰胺染料为结构单元，研究发现这类开关染料在体内和体外的酸性环境下化学稳定。对3-伯胺或仲胺取代罗丹明螺酰胺进一步共轭修饰实现可见光(400nm)激活螺环开关。将琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和苄基鸟嘌呤(BG)引入罗丹明螺酰胺，这可以将荧光开关探针非特异性或特异性标记到生物蛋白上，通过STORM技术就可以对目标蛋白进行超分辨成像。