[发明专利]通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法

权利要求书

1.通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01、将样本奶粉溶解在溶剂中，得到样本溶液；

S02、根据不同种类的样本奶粉所对应的过敏源信息筛选过敏蛋白；

S03、(1)在所述的样本溶液中依次加入三乙基碳酸氢铵缓冲液和二硫苏糖醇，反应完成后，加入碘代乙酰胺，并放置于暗处或遮光反应，得到待酶解样本溶液；

(2)于待酶解样本溶液中加入蛋白酶，酶解反应完成后，即得到酶解溶液；

S04、在酶解溶液中，分别依次加入体积分数为4％的CH₂O溶液和浓度为0.6mol/L的氰基硼氰化钠溶液，充分反应后，分别依次加入160μL体积分数为1％的氨水溶液与80μL体积分数为5％的甲酸溶液，反应完成后，得到二甲基标记完成的轻标溶液；

S05、在酶解溶液中，分别依次加入体积分数为4％的¹³CD₂O溶液和浓度为0.6mol/L的氰基硼氰化钠溶液，充分反应后，分别依次加入160μL体积分数为1％的氨水溶液与80μL体积分数为5％的甲酸溶液，反应完成后，得到二甲基标记完成的重标溶液，即得到内标溶液；

S06、将所述轻标溶液与所述的内标溶液按体积比为1:1均匀混合，并采用纳流液相色谱串联Q-Exactive高分辨质谱配合相关蛋白质组学软件鉴别得到候选肽段，并保留所述的候选肽段的质谱信息；

S07、应用蛋白质组学软件将所述的质谱信息导入三重四级杆质谱仪中，建立相关多反应检测方程，得到可成功转化的候选肽段的质谱信息；

采用超高性能液相色谱串联三重四级杆对所述的质谱信息进行多次平行相对定量分析，并考察每条候选肽段的平均峰面积与相应候选肽段峰面积比的相对标准偏差之间的关系，筛选留下相对标准偏差<10％的候选肽段，得到特征肽段。

2.根据权利要求1所述的通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，所述待酶解样本溶液包括多个子样本溶液，每个子样本溶液对应的酶解时间均不同。

3.根据权利要求2所述的通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，在步骤S07之后，还包括步骤S08，所述步骤S08包括：在所得到的特征肽段中，以每种特征肽段最大峰面积比所在时间点的肽段产出率为100％，计算每种特征肽段在预设酶解时间范围内的肽段产出率，通过每种特征肽段的肽段产出率对特征肽段进行分类，从而筛选得到最优特征肽段。

4.根据权利要求2所述的通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，每个子样本溶液对应的酶解时间取1、2、3、4…24h。

5.根据权利要求1所述的通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，在步骤S01中，溶剂选用去离子水。

6.根据权利要求1所述的通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，在步骤S02中，所述的蛋白酶是胰蛋白酶、蛋白酶K以及V8蛋白酶中的一种。

7.根据权利要求1所述的通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，在步骤S03中，酶解温度为36～38℃。

8.根据权利要求1所述的通过考察候选肽段的酶解稳定性筛选出奶粉过敏蛋白的特征肽段的方法，其特征在于，在步骤S06中，所述纳流液相色谱的条件为：选用EASY-nLC1200系统配用AcclaimPepMap100C18液相色谱前置柱与AcclaimPepMap100C18液相色谱柱，A相为1％甲酸水溶液，B相的洗脱条件为1％甲酸乙腈溶液，流量为250nL/分钟；B相2分钟内从3％增加到7％，接下来的40分钟内增加到20％，随后8分钟增加到33％，2分钟后增加到84％并保持8分钟，整体时间为1小时，进样量为1μL。