[发明专利]一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法

说明书

本发明提供一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，涉及重组质粒标准品量化定标方法领域。一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，包括如下步骤：配制含有ddPCR™Supermix for Probes、引物、探针和模板的反应体系；采用微滴发生器将反应体系进行微滴化处理；将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应；使用微滴读取仪读取结果数据，计算重组质粒标准品浓度。本发明定量检测方法准确性高、灵敏度高、重复性好、适用性广的、基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。

技术领域

本发明涉及重组质粒标准品量化定标方法领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。

背景技术

空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种重要的食源性致病菌，是导致人类细菌性腹泻的主要原因之一。近年来对空肠弯曲菌的研究逐渐增多，建立了多种基因检测方法。其中实时荧光定量PCR方法的应用最广，被国内外多个权威检测机构所认可。在基因检测方法的研究中，标准品是关键因素之一。目前标准品使用较多的是细菌的稀释液和目的片段的重组质粒。细菌稀释液一般采用平板培养法计数，但培养过程往往受多种因素影响，因此平板计数所得到的细菌数量与实际值偏差较大。目的片段重组质粒一般采用分光光度法测得核酸质量，然后通过质量摩尔数公式来进行理论推算，因此计算的数值与实际有效扩增片段的数量差异较大。如果应用上述两种方法得出的标准物质来建立空肠弯曲菌的基因检测方法，则在方法研究所得到的灵敏度、重复性方面会存在不可避免的偏差。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确性高、灵敏度高、重复性好、适用性广的、基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种基于微滴式数字PCR的空肠弯曲菌重组质粒标准品定量检测方法，包括如下步骤：

(1)配制含有ddPCR^TMSupermix for Probes、引物、探针和模板的反应体系；

(2)采用微滴发生器将反应体系进行微滴化处理；

(3)将微滴化处理后的反应体系转移至PCR仪上，进行PCR扩增反应；

(4)使用微滴读取仪读取结果数据，计算重组质粒标准品浓度。

优选的技术方案中，所述反应体系含有ddPCR^TMSupermix for Probes 10μL、上下游引物各0.5μL、探针0.25μL、去离子水3.75μL、模板5μL。

优选的技术方案中，PCR扩增反应条件如下：95℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s，共40个循环；98℃保持10min。

优选的技术方案中，PCR扩增反应中，升温速度为1-5℃/秒，降温速度为1-5℃/秒。

优选的技术方案中，微滴发生器和微滴读取仪来自Bio-Rad公司QX200^TM DropletDigital^TM PCR系统。

优选的技术方案中，所述重组载体是将空肠弯曲菌完整的或部分hipO基因插入pCzn1载体后得到的；或者所述重组载体是将空肠弯曲菌完整的或部分hipO基因插入pCzn1载体、经酶切线性化后得到的。

优选的技术方案中，所述引物包括C5-F和C5-R，所述C5-F的序列如SEQ ID NO:2所示，所述C5-R的序列如SEQ ID NO:3所示；所述探针的序列如SEQ ID NO:4所示，5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。