[发明专利]差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置

说明书

本发明属于化学物质检测技术领域，涉及一种差动共焦分立荧光光谱及荧光寿命探测方法与装置。本发明基本思想是将具有精密轴向分辨率的差动共焦物体表面定位技术和分立荧光光谱和荧光寿命测量技术相融合；利用差动共焦技术解决待测样品表面三维形貌的高精度测量，同时利用分立荧光光谱及荧光寿命探测技术解决待测样品表面各点的荧光光谱及荧光寿命的高灵敏度检测，进而得到三维高分辨空间物质成分分布信息。本发明首次将差动共焦测量技术和荧光物质成分探测技术相融合，保证荧光成像系统在待测样品表面每一个位置都具有相同的横向分辨率，并最终将测得的荧光光谱分布和三维形貌进行精确的对应。此技术在生物学，医学，材料科学以及临床医学诊断领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于化学物质检测技术领域，不仅可以对物质的成分进行高灵敏度鉴别，还可以对物质成分的空间分布进行探测，将在生物学、医学、材料科学等研究领域及临床医学诊断方面具有重要应用。

背景技术

在生物、物理、化学和材料等学科领域，光谱检测和分析由于其具有非常高的灵敏度、分子特异性和非接触测量特性已经成为基础研究的一项基本的测量手段。其中，荧光光谱检测是利用物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。特别是对大多数有机化合物来说，其产生的荧光通常具有很强的特异性，指向性。。因此荧光光谱检测尤其适合运用于这些荧光特异性强的有机化合物的成分分析。在工业界，荧光光谱检测可用于各种污染物的成分检测、工业原料成分检测、石油原油成分检测等等。在食品安全领域，荧光光谱检测可用于对食品的霉变细菌、农药残留量等信息进行检测和监控。在医学领域，荧光光谱技术和荧光显微成像技术为肿瘤和癌症的实时成像和检测提供了新的方向，并且有望发展成为适用于临床诊断的医疗技术。由此可见，荧光光谱检测技术是一种非常实用而且有前景的光学检测手段。

通常，荧光测量技术包括荧光光谱测量和荧光寿命测量两种方式。荧光光谱测量技术是通过对从待检样品发出荧光的光谱分布检测来实现的，即固定激发波长，探测出样品的发射光强与入射光波长的关系曲线。荧光光谱技术经常跟荧光探针相结合，应用在DNA测序、高分子材料科学、生物荧光成像等领域。与此相对，荧光寿命检测是测量脉冲激光激发后从待检样品中激发出的荧光强度降到激发时的荧光最大强度的1/e所需要的时间。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件直接相关，因此从样品所激发出来荧光的寿命值是绝对的，不受激发光强度、荧光团的浓度和光漂白等因素的影响，且不受其他限制强度测量因素的制约。通过对样品进行荧光寿命测量还可对待测样品所处的微环境的很多生化参数如pH值、离子浓度、温度等分布进行定量测量。

然而，在对待测样品的表面激发荧光进行扫描成像的过程中，当待测样品表面存在起伏不平时，无法保证激发光束在待测样品表面不同位置的光斑大小一致，进而导致检测系统在不同位置处分辨率无法保持一致。尤其对于一些起伏较大的样品，甚至存在由于系统测量物镜工作距离很小造成在样品扫描过程中物镜碰撞待测样品的可能性，最终不但得不到样品表面的荧光分布成像，而且会导致系统物镜的表面受到污染。

共聚焦技术，采用针孔滤除焦点外的散射光，相对于传统显微镜具有较高的横向分辨率，并且具有独特的轴向层析能力。而差动共焦技术，则是在共焦显微测量原理的基础之上，在共焦检测光路中加入分光棱镜，光强信号被分为两路，将针孔分别放置在物镜像焦平面前后对称的位置上，通过检测透过针孔的两路光强的差值，即系统的差动共焦响应信号来反映物体偏离焦平面的距离。相比于共焦探测系统，差动共焦探测系统利用了灵敏度最大的过零点信息来定位被测样品的表面，定位精度显著提高。且差动共焦响应曲线具有双极性，可用的线性区域也很大，能根据探测到的差动共焦信号大小及其极性直接得到其表面高度信息，不需要将焦点完整地扫描过样品表面。此外，差动方式可以有效抑制光源的漂移和传感器的电子漂移，以及被测物表面反射率波动等产生的共模噪声，提高系统的信噪比和稳定性。