[发明专利]一种优质高产三七的鉴定方法在审
| 申请号： | 201810224481.2 | 申请日： | 2018-03-19 |
| 公开（公告）号： | CN108277262A | 公开（公告）日： | 2018-07-13 |
| 发明（设计）人： | 郑云;李世鹏;廖沛然;崔秀明 | 申请（专利权）人： | 昆明理工大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 650093 云*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 三七根 高产 实时荧光PCR 第一链 合成 实时荧光定量PCR 荧光定量PCR检测 荧光定量PCR 待检测样品 特异性引物 总RNA提取 检测结果 快速鉴定 实验鉴定 相对定量 植株 靶基因 试剂盒 解析 | ||
1.一种优质高产三七的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)待检测三七根样品总RNA提取；
(2)将待检测样品总RNA中的miRNA反转录成cDNA，并合成第一链，用于miRNA实时荧光PCR分析；
(3)将待检测样品RNA反转录成cDNA第一链，用于靶基因实时荧光PCR分析；
(4)以RNA cDNA第一链和miRNA cDNA第一链为模板，用特异性引物和试剂盒进行荧光定量PCR检测；以PnACT2为三七的内参基因，是SPL5的对照组；以5.8S ribosomal RNA为miR156g-5p的对照组；
(5)根据实时荧光定量PCR检测结果进行判断；
其特征在于，步骤(2)中所述miRNA为miR156g-5p，步骤(3)中所述RNA为SPL5，步骤(4)中所述特异性引物如下表所示：
。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中，
对miRNA cDNA第一链的RT-qPCR反应条件为：
a、94℃2min，1个循环，起始模板变性；
b、94℃20s，35-45个循环，PCR循环中模板变性；
c、60℃34s，35-45个循环，退火，延伸。
对RNA cDNA第一链的RT-qPCR反应条件为：
a、95℃2min，1个循环，起始模板变性；
b、95℃15s，60℃1min，40个循环，PCR扩增。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(5)中采用相对定量解析方法即2-△△Ct法(△△Ct＝(Ct目标基因-Ct内参基因)-(Ct对照基因-Ct内参基因))计算目标基因在样品中的相对表达水平。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(5)中判断优质高产三七的方法是：
(1)miR156g-5p的实时荧光PCR结果即：2-△△Ct高于6.396，
或
(2)靶基因SPL5的实时荧光PCR结果即：2-△△Ct低于0.046，
则待检测样品为优质高产三七植株。
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