[发明专利]热稳定性提高的低温淀粉酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了热稳定性提高的低温淀粉酶突变体及其应用。本发明将低温淀粉酶进行定点突变最终筛选得到了热稳定性显著提高的3个低温淀粉酶突变体，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示；Tm值测定结果表明三个突变体的Tm值均比野生型淀粉酶有明显提升，其中SEQ ID No.5所示突变体的Tm值相比野生型提高了4.77℃；残余酶活力比较试验结果发现，三个突变体的残余酶活力相比野生型淀粉酶分别提高了1.6倍，2.4倍和2.6倍；酶动力学参数测定结果表明，本发明低温淀粉酶突变体不仅可显著提高淀粉酶的热稳定性还可有效提高淀粉酶的催化效率。

技术领域

本发明涉及淀粉酶突变体，尤其涉及热稳定性提高的低温淀粉酶突变体，本发明进一步涉及该低温突变体的应用，属于淀粉酶突变体领域。

背景技术

淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于淀粉转化、洗涤行业、燃料乙醇生产、食品工业、发酵、造纸、纺织品工业和医药行业等，占了整个酶制剂市场份额的30％。α-淀粉酶根据最适反应pH值的不同，分为酸性淀粉酶、中性淀粉酶和碱性淀粉酶。

α-淀粉酶能够水解淀粉分子内部α-1,4-葡萄糖苷键，水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖，在食品、纺织、医药和饲料等工业领域广泛应用。碱性淀粉酶在强碱性条件下水解淀粉的潜力，使其可以应用于淀粉加工、纺织退浆以及用于自动洗衣机的洗涤剂添加等工业领域。为了满足印染行业连续化生产的要求，需要淀粉酶能够在高温下使用，但是目前大多数淀粉酶在高温下的稳定性较差。

定点突变和定向进化是提高工业用酶热稳定性的两种主要手段。定向进化虽然不需要准确的酶分子结构信息，但是需要建立一种能够从大量的突变株中快速简便的筛选到优势菌株的方法。而定点突变，与定向进化相比，是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶热稳定性的方法。

因此，对低温淀粉酶进行分子改造，筛选得到更适合工业化应用的热稳定性提高的低温淀粉酶突变体，对于淀粉酶的工业应用将具有重要的意义。

发明内容

本发明主要目的是野生型低温淀粉酶进行定点突变以期筛选得到热稳定性显著提高的淀粉酶突变体；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明为了得到热稳定性显著提高的淀粉酶突变体，采用NAMD 2.12在CHARMM22磁力场下对野生型低温淀粉酶(SEQ ID No.1)蛋白进行分子动力学模拟，利用FoldX软件计算突变体对蛋白质解折叠自由能的影响，筛选出对蛋白质热稳定性有正效应的点，然后再进行多序列比对，把位于保守区和距离活性中心比较近的突变位点排除掉，最终筛选得到了3个热稳定性显著提高的低温淀粉酶突变体，即：S255K是将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第255位丝氨酸突变为赖氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ IDNo.3所示；S340P是将SEQ ID No.2 所示的野生型低温淀粉酶的第340位丝氨酸突变为脯氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；S255K/S340P是将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第255位丝氨酸突变为赖氨酸以及将第 340位丝氨酸突变为脯氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

本发明还涉及编码SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示氨基酸的基因以及含有这些基因的表达载体以及宿主细胞。

本发明进一步涉及用编码SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5 所示氨基酸的基因制备淀粉酶突变体的方法。

本领域人员可以采用本领域的常规方法制备所述的淀粉酶突变体，譬如，采用表达载体，以酶的形式表达；具体的，将编码SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示氨基酸的基因与表达载体可操作的连接得到重组表达载体，将该重组表达载体导入到宿主细胞中诱导酶的表达，收集并纯化所表达的产物即可。