[发明专利]一种粪便基因标志物的筛选及应用

说明书

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及到一种基于高通量宏基因组学测序分析的粪便基因标志物的筛选及应用。本发明通过提取粪便DNA使用鸟枪法进行宏基因组学测序和ROC曲线分析，筛选出基因标志物，并通过荧光实时定量PCR验证基因标志物获得其一致性。本发明首次在中国PD患者粪便中进行宏基因组高通量鸟枪测序技术测定，建立粪便基因标志物的筛选方法，发现PD患者粪便中众多差异基因，从中筛选出25个粪便基因标志物，可作为PD诊断标志物，用于PD患者的辅助诊断，对于丰富和深入了解PD的病理机制等，具有重要的学术意义和应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及到一种基于高通量宏基因组学测序分析的粪便基因标志物的筛选及应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是中老年人常见的一种缓慢进展的神经系统变性疾病，严重影响患者的生活质量。主要临床特征为运动症状，包括静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态异常等。随着我国人口老龄化进程的加快，PD发病率日益增高，发病人数逐年增加，目前我国的PD病患者已超过200万。PD的主要病理变化为α-突触核蛋白(a-synuclein,a-syn)的异常聚集导致中脑黑质致密部多巴胺能神经元的选择性丢失和残存神经元胞浆内路易小体的形成。当PD病患者出现典型的运动症状，此时中脑黑质多巴胺能神经元已存在严重丢失，所以PD早期诊断、早期干预显得尤为重要。目前PD的诊断主要基于患者的临床表现及医生的临床经验，这就导致了不少PD患者被漏诊或误诊。因此，一方面亟需找到灵敏可靠的生物学标志物，另一方面需要操作简便、经济的辅助检查手段为PD诊断提供帮助。

目前已有的关于PD生物学标志物研究主要集中在临床症状、神经影像和生物化学几方面：

1、PD临床症状：运动症状是目前PD诊断的主要依据，然而运动迟缓、肌强直和静止性震颤这些典型的运动症状只有在多巴胺能神经元大量缺失时才出现，不能作为早期诊断的标记物。非运动症状如嗅觉减退、快动眼睡眠行为障碍以及便秘的发生可远早于运动症状，但对PD诊断的敏感度和特异度不高。

2、神经影像：目前已知的PD诊断的影像学方法有正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography，PET)、单光子发射计算机断层成像术(single-photonemissioncomputed tomography，SPECT)，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等，均因价格昂贵、实践性不强或特异性差难以推广。

3、生物化学：关于PD早期诊断的生物化学标志物研究涉及免疫、炎症、氧化应激、细胞凋亡等多个领域，其中以α-syn最具研究前景。Borghi等首次在脑脊液中检测到α-syn后，有关该项生物学标志物的研究备受关注。然而，PD患者脑脊液α-syn表达水平的变化存有较大争议。由于脑脊液检测在临床应用中的限制，一些研究者开始关注外周血及唾液α-syn表达变化。但是到目前为止，来自血液和唾液样本的研究结果并不完全相同。

因此，至今尚未发现一个敏感度和特异性高，可在临床广泛应用的PD诊断的生物学标记物。

发明内容

本发明的目的是提供一种粪便基因标志物的筛选及应用。本发明目的寻找一个敏感度和特异性高可供PD诊断的生物学标记物。

本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种粪便基因标志物的筛选方法，包括如下步骤：

(1)收集帕金森病患者与其健康配偶的粪便，于-20～-80℃下保存；

(2)提取(1)中粪便基因DNA；

(3)鸟枪法测序后进行生物信息分析，建立参考基因集，从帕金森病患者和健康配偶的差异基因中筛出目的基因序列用作基因标志物,进行受试者工作特征(receiveroperating characteristic,ROC)曲线分析，明确其疾病区分能力，具体方法包括如下：