[发明专利]一种α-葡萄糖苷酶高产菌株的高效高通量筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于特定培养基组成的筛选平板和96浅孔细胞培养板结合的α‑葡萄糖苷酶高产菌株的高效高通量筛选方法，属于微生物技术领域。本发明包括菌株的亚硝基胍(NTG)诱变；添加α‑甲基葡萄糖(α‑MG)和麦芽糖的选择性平板初筛；基于96浅孔细胞培养板的高通量筛选；摇瓶复筛及遗传稳定性考察。本发明对传统的筛选方法进行了改进，有效地降低了工作强度和实验成本，大大提高了高产菌株的筛选效率。

技术领域

本发明属于微生物菌种筛选技术领域，涉及一种α-葡萄糖苷酶高产菌株的高效高通量筛选方法。

背景技术

α-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.20，α-Glucosidases)为淀粉水解酶类中的一种，主要在细胞外起作用。它从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，通常把它们归类于水解酶第3类,主要水解二糖、低聚糖、芳香糖苷，能以蔗糖和多聚糖为底物。同时，它还具有转糖苷作用，可将低聚糖中的，α-1，4-糖苷键转化成α-1，6-糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。它主要应用于低聚异麦芽糖(IMO)的生产，而IMO是一种公认的有效的双歧杆菌生长的促进因子，具有良好的保湿性、抗龋齿性及难发酵性，已广泛应用于食品、医药、饲料等工业上。

α-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。目前已经进行研究的α-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外，绝大多数均来自于微生物中。其中以黑曲霉来源的α-葡萄糖苷酶转糖苷作用最为突出。市售大部分α-葡萄糖苷酶酶制剂产品来源自黑曲霉，但是黑曲霉野生菌株一般产量都很低，因此运用诱变育种的方法来获得高产菌株的研究日益增加。而诱变后菌种筛选工作量巨大而效率非常低，是目前制约工业微生物生产发酵的重要因素。管立忠(黑曲霉α-葡萄糖苷酶产生菌的诱变选育与低聚异麦芽糖生产的研究.广西大学硕士学位论文,2007)根据诱变后菌株菌落形态进行摇瓶初筛，但这种筛选方法随机性较高、相关性较差且工作量大；陈桂光等(A high-throughput method for screening of Aspergillus niger mutants with hightransglycosylation activity by detecting non-fermentable reducing sugar[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2011,27(6))使用添加曲里本蓝和淀粉的平板进行筛选，但淀粉可同时作为多种酶的底物，比如糖化酶和α-葡萄糖苷酶，所以该方法针对性不高，且易被糖化酶干扰；谢振荣等(α-葡萄糖苷酶高产菌株HB-9-5的选育及产酶条件的优化.生物技术通报，2010(06):206-211.)根据菌株在添加有酶活测定底物PNPG平板上透明圈大小进行筛选，但PNPG价格较为昂贵，所以此方法成本过高；而同样作为α-葡萄糖苷酶酶活测定底物的α-甲基葡萄糖和麦芽糖价格相比PNPG较为低廉，且α-甲基葡萄糖和麦芽糖也可作为碳源供给菌株生长，所以α-甲基葡萄糖不仅可以作为筛选平板碳源针对性的初筛菌株，也可作为发酵培养基碳源进行复筛。黑曲霉霉菌菌落扩散速度快、范围广，如不抑制菌落的扩散，就很难挑选到单菌落。孟加拉红既可以抑制黑曲霉单菌落的扩散，又可以更容易的辨别和挑选单菌落。

本发明旨在建立一种高效快速筛选α-葡萄糖苷酶高产菌株的高通量筛选方法。通过诱变育种，结合特定培养基的筛选平板初筛，和高通量方法筛选α-葡萄糖苷酶高产菌株，既可以提高工作效率，降低成本，缩短实验周期，又能大幅度提高筛选速率。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于筛选平板和96浅孔细胞培养板结合α-葡萄糖苷酶的高产菌株的高通量筛选方法，可快速有效地提高黑曲霉产α-葡萄糖苷酶酶活。