[发明专利]一种银杏保健品中掺杂槐角的鉴定方法

说明书

本发明涉及槐角分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的判定市场所售银杏叶保健品中是否掺杂槐角。本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的任何样品。因此，能够实现银杏叶提取物及主要标签成分为银杏叶提取物的保健品的快速、准确鉴定。

技术领域

本发明属于中药来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种应用分子身份证鉴定银杏叶提取物、银杏叶保健品等产品中掺杂槐角的方法。

背景技术

银杏叶(Ginkgo folium)为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶。银杏提取物是以银杏的叶为原料，分离纯化提取的物质，其主要活性成分是黄酮和萜类内酯。现代药理研究表明，银杏黄酮和萜类内酯具有改善心血管系统，调血脂，抗氧化，抗衰老等作用。银杏叶提取物已成为国内外普遍使用的重要原料以及制剂之一。目前，中国食品药品监督管理局已经批准了数十种银杏叶提取物剂型，包括药品与保健食品，主要是银杏叶片、胶囊。根据《中华人民共和国药典》(2015版)银杏叶提取物含量测定项下相关要求，银杏叶提取物按干燥品计含总黄酮苷不得少于24.0％，含萜类内酯不得少于6.0％。黄酮类物质是银杏叶中主要药效成分，也是治疗心脑血管疾病主要活性成分。据报道，由于豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥成熟果实槐角(Sophorae fructus))中黄酮类化合物含量较高，故现今市场上许多不法商家在银杏叶产品中掺入槐角以提高银杏叶产品中黄酮类化合物的含量。传统的鉴定方法，如基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定等在提取物及其相关产品的鉴定中明显受限。现今对银杏叶保健品、提取物的鉴定和质量控制主要依靠高效液相色谱法(HPLC)，但槐角与银杏叶均含有黄酮类化合物，故高效液相色谱法对银杏叶提取物及其相关产品的鉴定存在局限性。因此，急需建立一种银杏叶提取物及其相关产品中掺杂槐角的鉴定方法。

如今分子鉴定已广泛应用于中药材中，而针对提取物及其相关产品而言，DNA的提取会更加困难，扩增长序列存在一定的难度，或者扩增质量不佳影响鉴定结果。本发明开发了一段槐特异的分子身份证(序列)，片段长度为25bp，可以用于银杏叶提取物及其相关产品中掺杂的槐角的准确鉴定。本专利用于鉴定银杏叶提取物及其相关产品中是否掺杂槐角。

发明内容

本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷并提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的银杏叶提取物及其相关产品中掺杂槐角的鉴定方法。本发明所利用的分子身份证是在大量的槐角ITS2序列中经过筛选和与BLAST比对后确定了一段25bp的槐分子身份证序列，该分子身份证具有种内保守、种间变异较大的特点。经过BLAST分析，证明该分子身份证为槐特有，种内序列相似度为100％(见图1)，与其它物种的序列相似度较低。若未知样品DNA扩增获得此段分子身份证，则可判定样品为槐角或含有槐角。

本发明提供了一种银杏提取物及其相关产品中掺杂槐角的分子鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。当存在所述分子身份证时，鉴定待测样品中存在槐角。

可选的，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物：

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证，如果含有此分子身份证，则证明该样品中存在槐角。

本发明对于PCR所使用的引物有特别的限制，仅为扩增出槐角，特异性较高，因此在PCR扩增的过程中为了达到目的条带的准确性，采用专门设计的特异引物。所述PCR扩增使用的引物为：

HM-1F：5′-TGTGTCTGTGGTGGAGAG-3′

HM-1R：5′-TCCGTGGGTCACATAGTC-3′

上述PCR扩增的反应程序为：