[发明专利]一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法

说明书

本发明涉及细胞扩增培养技术领域，公开了一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括：1）用肝素钠对全血抗凝，用PBS稀释；2）将稀释后的抗凝全血平铺加到淋巴细胞分离液的液面上；3）离心，吸取白膜层，将其吹打混匀，离心，弃上清液，重复洗涤；4）去除CD3+淋巴细胞，对外周血单核细胞抗体染色，分选细胞；5）将CD3‑淋巴细胞稀释，加入IL‑2、IL‑15、IL‑21和IL‑7，进行扩增。本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大降低了细胞免疫原性，同时用4种特定细胞因子按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大幅提高了NK细胞在治疗中的安全性。

技术领域

本发明涉及细胞扩增培养技术领域，尤其涉及一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法。

背景技术

NK细胞又称为自然杀伤细胞，属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞的5％～15％，是重要的免疫细胞。科学家在1975年首次鉴定到了NK细胞，这类细胞能够在缺少T、B细胞的情况下直接杀伤肿瘤细胞。与具有细胞毒性的CD8+T细胞不同，NK细胞杀伤肿瘤细胞时不需要预先致敏可以直接杀伤MHC阴性的肿瘤细胞，这使得NK细胞在过继细胞免疫治疗中被广泛应用。

但由于NK细胞在人外周血中的含量极低及肿瘤组织中分布频率较低(＜10％)，仅占单个核细胞的5％-10％，极大地限制了NK细胞作为过继免疫细胞在临床上的应用。多年来，人们一直尝试能在体外实现NK细胞的大量扩增，目前体外扩增培养后仅可以使NK细胞扩增几倍或十几倍，纯度亦不理想，不能满足实际的应用。因此有必要开发出一种高扩增倍数以及高纯度的NK细胞体外扩增工艺，用于研究NK细胞的功能并为肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大地降低了细胞免疫原性，同时用4种特定的细胞因子(IL-2、IL-15、IL-21和IL-7)按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大大提高了NK细胞在治疗中的安全性。

本发明的具体技术方案为：一种高效体外扩增外周血NK细胞的方法，包括以下步骤：

1)无菌状态下，取全血并用肝素钠抗凝，得到抗凝全血，然后用PBS稀释抗凝全血。

2)另取淋巴细胞分离液，将稀释后的抗凝全血缓慢平铺加到淋巴细胞分离液的液面上，保持两液面界面清晰。

3)对步骤2)所得液体离心处理，吸取血浆层与分离液层之间一层薄而致密的白膜层，将白膜层置于另一离心管中，用MACS吹打混匀，离心处理，弃上清液，再用MACS重复洗涤至少2次。

4)利用磁珠分选法去除CD3+淋巴细胞，外周血单核细胞用CD3-beads抗体染色后，将细胞加于MACS柱子中进行分选细胞，获得CD3-淋巴细胞。

5)用FBS/RPMI 1640将CD3-淋巴细胞稀释至浓度为1*10⁴/mL，取24孔板，在每孔中加入1mL细胞，同时加入10-50ng/mL的IL-2、10-50ng/mL的IL-15、10-50ng/mL的IL-21和10-50ng/mL的IL-7，进行扩增NK细胞。

本发明在扩增前剔除CD3+细胞，极大地降低了细胞免疫原性，同时用4种特定的细胞因子(IL-2、IL-15、IL-21和IL-7)按特定配比实现了对NK细胞的激活和扩增，既保证了NK细胞的扩增倍数，又大大提高了NK细胞在治疗中的安全性。