[发明专利]一种木聚糖酶表达、纯化方法在审
| 申请号： | 201810233502.7 | 申请日： | 2018-03-21 |
| 公开（公告）号： | CN108546696A | 公开（公告）日： | 2018-09-18 |
| 发明（设计）人： | 万群;张晓帅;李治宏 | 申请（专利权）人： | 南京农业大学 |
| 主分类号： | C12N9/42 | 分类号： | C12N9/42;C12N15/70 |
| 代理公司： | 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 | 代理人： | 董建林 |
| 地址： | 210000 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 木聚糖酶 大肠杆菌 基本培养基 目的蛋白 糖酶 种木 镍亲和层析柱 分子筛层析 镍亲和层析 基本营养 离子交换 目的基因 融合蛋白 微量元素 高纯度 有效地 生长 得率 酶切 | ||
1.一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S01，表达步骤：含有目的基因的大肠杆菌在基本培养基中生长，使目的蛋白大量表达；
S02，纯化步骤：含有目的蛋白的融合蛋白通过两步镍亲和层析和酶切，得到高纯度木聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：所述基本培养基包括碳源、氮源、水、无机盐和微量元素。
3.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：所述目的蛋白的前段含有6×His标签和促溶蛋白NusA。
4.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：大肠杆菌中目的蛋白的大量表达，需要加入异丙基-β-D-硫代半乳糖进行诱导表达。
5.根据权利要求4所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：所述诱导表达的时间是12～16h，温度是20～22℃。
6.根据权利要求1所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：纯化步骤的具体操作为：
步骤一：第一次镍亲和层析柱纯化包括以下步骤：柱平衡、上样、清洗、低浓度咪唑清洗液梯度洗脱、高浓度咪唑清洗液洗脱，第一次镍亲和层析柱与融合蛋白中的6×His标签之间具有特异性的吸附作用，吸附后高浓度咪唑与6×His标签竞争吸附，从而将融合蛋白洗脱下来；
步骤二：酶切步骤：在步骤一洗脱下来的融合蛋白溶液中加入TEV酶，TEV酶可将融合蛋白中的6×His标签和促溶蛋白NusA切割下来，使木聚糖酶呈游离状态；然后透析以降低溶液中咪唑的浓度；
步骤三：第二次镍亲和层析柱纯化包括以下步骤：柱平衡、上样、清洗、高浓度咪唑清洗液洗脱，上样溶液为酶切并透析后的溶液；收集上样流出液和清洗液，得木聚糖酶溶液；高浓度咪唑将吸附在镍亲和层析柱上的含有6×His标签和促溶蛋白NusA的蛋白清洗下来。
7.根据权利要求1或6所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：所述镍亲和层析柱的工作酸碱度是pH8.0～8.5。
8.根据权利要求6所述的一种木聚糖酶表达、纯化方法，其特征在于：低浓度咪唑清洗液梯度洗脱中的咪唑浓度为20～500mM；高浓度咪唑清洗液的浓度为1～1.2M。
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