[发明专利]一种利用三种混合抗菌剂进行莱茵衣藻培养过程中除菌的方法

说明书

一种利用醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟混合抗菌剂进行衣藻除菌的方法，方法：在TAP固体培养基平板上接种已被混合污染的衣藻，培养；配制混合除菌剂平板，该平板为添加醚菌酯，氨苄青霉素和头孢噻肟的TAP固体培养基，备用；将在TAP固体培养基上培养好的已被混合污染的衣藻转接划线到混合除菌剂TAP固体培养基平板上培养；将除菌剂平板上已经除过菌的衣藻再次转接划线至普通的TAP固体培养基平板上进行培养。本发明利用醚菌酯、氨苄青霉素和头孢噻肟三者相互配合使用从而有效的去除衣藻培养过程中细菌、真菌的污染。其具有广普性，高效低毒等特性，在珍贵衣藻藻种的保存以及提高后续实验的准确性这些问题上具有极好的推广应用价值。

技术领域

本发明涉及一种莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)除细菌与真菌的方法，具体为利用抗真菌剂醚菌酯与抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟三者混合进行衣藻培养过程中杂菌去除的方法。

背景技术

衣藻是一类真核单细胞藻类，素有“绿色酵母(green yeast)”之称。因其结构简单、生长快、世代时间短、易于培养和操作等特点作为模式生物被广泛应用于生物学研究，如植物的光合作用、趋光性与感光性研究、植物细胞周期的调控、植物细胞凋亡、叶绿体的发生、叶绿体DNA的损伤与修复、鞭毛和中心体等细胞骨架的研究、细胞间的信息传递等。近年来，随着基因测序与组学的发展与完善，有关衣藻基因及其功能分析的研究也快速发展：衣藻突变体文库的制备、衣藻基因基因干扰与敲出、衣藻基因的功能分析与鉴定等。然而，有关衣藻的理论基础实验研究都需要在无菌的条件下进行，但在实验室环境内细菌、真菌种类很多，如何有效的防止实验及保种过程中衣藻不被杂菌污染、以及污染后如何有效的清除杂菌是难题之一。

在此之前衣藻除菌研究中，包括有物理方法和化学方法。研究表明用戊唑醇和奈啶酮酸分别清除莱茵衣藻培养过程中的细菌、真菌的污染(Grover,2006,Med.Chem.；Dimitrov,2014,Sci.Total Environ.；Wang,2016,BioTechniques)可以；多菌灵、嘧菌酯等可以有效去除真菌的污染(Mahan,2005,BioTechniques；Kan,2009,J.Phycol.)，但也并不是始终都有效的。因此，新型的除菌方法来针对衣藻培养过程中的细菌、真菌污染是迫在眉睫的，以便于除菌剂的混合使用。

因细菌和真菌在细胞结构、代谢方式等方面存在巨大差异，故除细菌、真菌需分别进行考虑。即分别选用针对细菌的抗菌剂和针对真菌的抗菌剂，两者相互配合使用，从而达到清除细菌、真菌的目的。细菌种类繁多，依革兰氏染色结果的不同可将细菌分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类。真菌的种类也很多，实验室污染衣藻培养的真菌主要是霉菌和酵母。对于抗菌剂的选择，原则上是选用广谱、高效、且对衣藻生长无明显抑制的抗菌剂。由于加抗菌剂的目的是保护衣藻，因此在选用抗菌剂时必须要考虑抗菌剂不能显著抑制衣藻的生长，应做到“使用最少的剂量，达到满意的效果”。

本发明利用抗真菌剂醚菌酯与抗细菌剂氨苄青霉素和头孢噻肟三种混合进行衣藻杂菌去除。抗真菌剂醚菌酯属于甲氧基丙烯酸酯类杀真菌剂，其机理是通过阻断细胞色素b与c之间的电子传递链，进而抑制线粒体的功能，从而使ATP的合成受阻。抗细菌剂采用氨苄青霉素和头孢噻肟联用。氨苄青霉素为半合成的广谱青霉素，对大多数革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，但对革兰氏阴性菌效果不佳。头孢噻肟为第三代头孢菌素，对革兰阴性菌有较强的抗菌效能，且对革兰阴性菌产生的广谱β-内酰胺酶高度稳定，但对革兰氏阳性菌效果不佳。两种抗生素的作用机理类似，均是通过抑制细菌细胞壁肽聚糖的生成而达到杀菌的目的，而衣藻细胞壁不含肽聚糖，故氨苄青霉素和头孢噻肟对衣藻生长影响不大。通过对三者联合使用，优劣互补，使得该方法具有广谱杀菌特性，适用于衣藻各个研究环境下细菌真菌污染的去除。

发明内容