[发明专利]一种利用EPA的甘油二酯酰基转移酶及其应用

说明书

本发明公布了一种高效利用二十碳五烯酸(EPA)作为底物合成甘油三酯(TAG)的甘油二酯酰基转移酶(DGAT)，以及含有该DGAT基因的表达载体在相应宿主中的应用。该DGAT在宿主细胞中的高效表达能够提供一种代谢拉力，增强EPA的合成并将EPA富集到中性油脂TAG上。通过此方法获得的富含EPA的宿主细胞可作为提取纯化EPA的原料或是直接作为添加剂用于功能食品、化妆品、水产及禽类养殖等行业。

技术领域

本发明属于生物代谢工程领域，具体涉及一种通过代谢工程提高中性油脂(甘油三酯，TAG)中多不饱和脂肪酸EPA含量的新方法。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA)属于ω-3多不饱和脂肪酸，和二十二碳六烯酸(DHA)一样是公认的高附加值营养成分，对人体健康起着非常重要的作用。但是，它们不能在人体内合成，必须从食物中摄取。目前，许多国家民众的EPA和DHA平均日摄取量远低于权威组织的推荐水平。过去几十年，人类摄取的EPA主要来源于深海鱼油。但野生海洋鱼类自身也无法合成EPA，只能从海洋微生物主要是微藻中富集。由于过度捕捞，全球海鱼储量迅速减少，超过100种鱼类已经或者濒临灭绝。此外，海洋污染的严重性导致鱼类中重金属、有毒有机物含量较高，不利于人体健康。并且鱼油不适合素食者食用，兼有难闻气味。随着国内外市场对EPA的需求量越来越大，鱼油EPA的产量远远无法满足巨大的市场需求。

近年来，研究探索可持续的ω-3多不饱和脂肪酸生产的生物新资源倍受关注，包括真菌、植物和微藻等。EPA的生物合成，从C18:0开始，需要一系列的去饱和与延长反应。第一个去饱和反应由C18:0-ACP去饱和酶(SAD)催化，生成C18:1。经由Δ12去饱和酶催化，C18:1转化成C18:2，然后进入ω-3或者ω-6途径，再经过Δ6去饱和酶、Δ6延长酶和Δ5去饱和酶最终生成EPA。这些去饱和酶反应需要消耗氧气和烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)。此外，EPA还有可能通过聚酮体合成酶(PKS)途径合成。PKS途径同样以乙酰辅酶A作为最初前体，不同之处在于它不需要氧气和去饱和酶的参与。EPA主要以偶联的形式整合在极性膜脂如糖脂和磷脂上，在甘油三酯(TAG)中的含量很低，不利于下游的提取和纯化。

TAG的合成途径主要有两条：依赖于酰基CoA的从头合成途径和不依赖于酰基CoA的替代合成途径。前者起始于3-磷酸甘油，经过三个脂酰化反应形成。最后一个脂酰化反应是该途径的限速步骤，由甘油二酯酰基转移酶(DGAT)催化，从酰基CoA上将酰基转移到二酰基甘油(DAG)生成TAG。DGAT有底物特异性，合成的EPA通过对EPA有高活力的DGAT可有效地整合到TAG上进行储存。如果缺乏有效的DGAT，EPA很容易被氧化降解，导致了中性油脂TAG上的EPA含量低。

发明内容

本发明的目的是针对上述中性油脂TAG上的EPA含量低的问题，提供含有能够高效利用EPA作为底物合成TAG的DGAT，及其基因和表达载体，通过代谢工程的方法，增强EPA的合成，并将EPA富集到中性油脂TAG上，从而提高EPA的生产。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

一种甘油二酯酰基转移酶(DGAT)，来源于小球藻Chlorella zofinginesis，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

一种DGAT基因，来源于小球藻Chlorella zofinginesis，编码下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质；

(ii)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)相同的功能。