[发明专利]高拷贝高表达重组质粒的构建及其在外源基因表达中的应用

权利要求书

1.高拷贝高表达重组质粒，其特征在于：

所述重组质粒由pUC ori复制启动子、Ampicillin抗性基因、cymR基因、T5启动子、cym-cmt操纵子、多克隆位点和His标签组成；

所述重组质粒的构建包括如下步骤：

SS01采用质粒pcDNA3.1(-)为模板，PCR扩增出含pUC ori复制启动子和Ampicillin抗性基因的片段pUC-Amp，

设计引物为：

pcDNA-5:TCGACCTCTAGCTAGAGCTT

pcDNA-3:TATATGGGCTATGAACTAA

SS02基因合成由cymR基因表达盒、T5启动子、cym-cmt操纵子和多克隆位点组成的cumate诱导表达DNA序列cymR-cuo；

SS03通过无缝连接将SS01得到的pUC-Amp和SS02得到的cymR-cuo两片段连接环合为原核系统表达载体DN-002；

SS04以质粒pET-28a为模板，PCR扩增出含T7启动子下游的多克隆位点以及6xHis编码序列和T7转录终止序列的DNA片段M-His-T，

设计引物为：

pET-5:CGCCCATGGTAACTTTAAGAAGGAGAT

pET-3:CGCCTCGAGATCCGGATATAGTTCCTC

SS05将步骤SS04中的DNA片段M-His-T和步骤SS03中的质粒DN-002用Nco I和Xho I进行双酶切，试剂盒纯化回收后用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取重组质粒DN-001，如SEQ ID NO1所示。

2.如权利要求1所述的高拷贝高表达重组质粒在表达有毒蛋白中的应用。

3.如权利要求1所述的高拷贝高表达重组质粒在外源基因表达中的应用。