[发明专利]一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液及培养方法

说明书

本发明提供了一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液，培养液包括神经细胞基础培养基，为神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的B27营养因子、0.5％～5％的双抗‑青霉素/链霉素、0.5％～5％的谷氨酰胺、0.5％～5％的丙酮酸钠、0.5％～1.5％的胎牛血清、2.5ug/mL～3.5ug/mL重组Shh蛋白。本发明培养得到的细胞能够增殖传代，Shh信号通路处于激活表达状态，致瘤性未受到影响，能够承受‑80℃冻存，可贴壁分化，从而为研究髓母细胞瘤发生发展的分子机制以及Shh信号通路调控分子机制提供了独特的细胞模型，以及高通量筛选化疗药物提供了重要的工具。

技术领域

本发明属于组织细胞培养技术领域，具体涉及一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液及培养方法。

背景技术

髓母细胞瘤(Medulloblastoma，简称MB)是儿童中最常见的恶性脑肿瘤，它主要出现在小脑中，并能迅速扩散到中枢神经系统中，通常认为，MB至少包括4种亚型，分别为Wnt亚型、Shh亚型、第三亚型和第四亚型。4种亚型中，Shh亚型约占人髓母细胞瘤的30％，由Shh信号通路的异常活化而引起。

星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类胶质细胞，对神经元的发育和功能起支持作用。近年来星形胶质细胞在脑肿瘤中的作用也得到一定程度上的阐述：有报道发现星形胶质细胞在神经发育、成人神经形成区域以及脑损伤的情况下分泌Shh配体。在髓母细胞瘤中，星形胶质细胞通过分泌Shh蛋白促进肿瘤细胞的增殖(Liu,Yongqiang,etal.Astrocytes promote medulloblastoma progression through hedgehogsecretion.Cancer research 77.23(2017):6692-6703.)。

由于易于培养保存，细胞株被广泛用于癌症的研究中。但是，研究表明，目前仍缺乏有效的Shh-MB体外细胞模型。目前用于髓母细胞瘤基础研究或临床前研究的细胞株中的Shh信号通路都呈失活状态。用遗传学手段在小鼠小脑中颗粒神经元前体细胞中敲除Shh通路的抑制性蛋白Patched(Ptch1)后，小鼠的脑中形成髓母细胞瘤。该模型目前被广泛地用于髓母细胞瘤的基础研究以及临床前研究中。然而，研究表明，用传统贴壁培养手段所培养的上述肿瘤细胞在体外Shh通路逐渐失活，使得肿瘤细胞逐渐停止增殖，这给髓母细胞瘤的基础研究及相应药物筛选带来了很大的困难。广泛采用的贴壁培养所采用的培养基为DMEM/10％FCS(Sasai,Ken,et al.Shh pathway activity is down-regulated incultured medulloblastoma cells:implications for preclinical studies.Cancerresearch 66.8(2006):4215-4222.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易于体外培养且能够增殖传代，培养后的髓母细胞瘤细胞的Shh信号通路处于激活表达状态且致瘤性未受到影响的体外培养脑肿瘤细胞的培养液及培养方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种体外培养脑肿瘤细胞的培养液，所述的培养液包括神经细胞基础培养基、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的B27营养因子、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的双抗-青霉素/链霉素、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的谷氨酰胺、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～5％的丙酮酸钠、添加质量为所述的神经细胞基础培养基质量的0.5％～1.5％的胎牛血清、重组Shh(Sonic hedgehog)蛋白。其中，所述的重组Shh蛋白的添加量为每1mL所述的神经细胞基础培养基加入2.5ug～3.5ug。

优选地，所述的重组Shh蛋白的添加量为每1mL所述的神经细胞基础培养基加入2.7ug～3.3ug。