[发明专利]基于PCR的无缝构建小RNA表达载体的方法

权利要求书

1.一种构建用于表达小RNA的表达载体的方法，其特征在于，包括步骤：

(1) 提供目的载体和用于扩增的第一引物和第二引物，其中第一引物为正向引物而第二引物为反向引物，所述的目的载体是环化的载体，且所述的目的载体的长度为3-20kb；

第一引物具有5'到3'如式(Ia)所示的结构，

U0-U1-U2-U3

式(Ia)

式中，

U0为无或选定长度的5'端的额外序列，所述选定长度为1-30nt；

U1为小RNA的正义链全部或部分的序列，或小RNA的全部或部分编码序列，U1的长度为20-30nt；其中，U0与全部或部分U1共同构成同源互补区，所述同源互补区互补于下述的第二引物的5'端，并且所述同源互补区的长度为8-20nt；

U2为无或连接序列，所述连接序列的长度为1-20nt；和

U3为与目的载体结合的正向引物结合区序列，U3的长度为12-35nt；

第二引物具有5'到3'如式(Ib)所示的结构，

D0-D1-D2-D3

式(Ib)

式中，

D0为无或选定长度的5'端的额外序列；

D1为小RNA的反义链全部或部分的序列，或小RNA的全部或部分编码序列；其中，D0与全部或部分D1共同构成同源互补区，所述同源互补区互补于所述的第一引物的5'端，所述的同源互补区在所述第一引物上的互补区位于所述第一引物的U0和/或U1区域；并且所述同源互补区的长度为8-20nt；

D2为无或连接序列，所述连接序列的长度为1-20nt；和

D3为与目的载体结合的反向引物结合区，D3的长度为12-35nt；

并且，所述的正向引物结合区和反向引物结合区在所述目的载体上是邻接的；

(2) 以所述目的载体为模板，用所述第一引物和第二引物，在聚合酶存在下进行低循环数扩增反应，从而获得扩增产物；

其中，所述低循环数扩增反应条件为：预变性98℃，2分钟；9-12个热循环，热循环条件为98℃，10秒，55℃，10秒，和72℃，40秒；以及72℃，3分钟；

(3) 在无缝克隆重组酶作用下，在体外对扩增产物进行环化反应，从而形成环化的表达载体，即为用于表达小RNA的表达载体；和

(4) 将所述环化的表达载体导入到体外细胞，所述细胞为表达小RNA的目标细胞，从而在所述细胞中产生小RNA；

其中，在所述环化的表达载体中，所述小RNA的编码序列位于启动子的下游以及终止子的上游；

所述的小RNA选自下组：shRNA、sgRNA、crRNA、基于内源microRNA结构的shRNA(shRNAmir)。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同源互补区的长度为9-15nt。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的启动子为人U6启动子(hU6)、小鼠U6启动子(mU6)，人H1启动子(hH1)及最小CMV启动子(mCMV)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，U0的长度为1-20nt。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，U2的长度为2-10nt。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，U3的长度为15-25nt。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目的载体的长度为5kb-10bp。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：将所述环化的表达载体转化进入大肠杆菌感受态细胞中以获得单克隆，从而进行测序验证、保存、和提取质粒。