[发明专利]麦草畏中间产物3;6-二氯龙胆酸脱氯酶DsmH2及其编码基因的应用

说明书

本发明公开了麦草畏中间产物3,6‑二氯龙胆酸脱氯酶DsmH2及其编码基因的应用。dsmH2其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长741bp，编码246个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。DsmH2是首次发现参与麦草畏下游代谢路径的谷胱甘肽硫转移酶类型的还原脱氯酶，能在30min内降解100mg/l的3,6‑二氯龙胆酸。因此，3,6‑二氯龙胆酸脱氯酶基因dsmH2在构建降解麦草畏转基因作物中应用潜能巨大。

技术领域

本发明属于环境微生物和农业领域，涉及参与除草剂麦草畏微生物降解过程中的两个脱氯酶及其编码基因的应用。

背景技术

农药是指应用于防治危害农作物的病虫、杂草等有害生物以及调节植物生长的化学试剂的总称，是保障现代农业生产力的重要手段，合理使用农药可以有效的防治作物病害，提高作物产量。除草剂的使用能有效减轻农业劳动强度，提高作物产量，但是随着除草剂的大量和长期使用，其残留对大气、土壤及水体造成的危害越来越严重，同时对人类健康造成威胁。农药污染修复技术可分为物理降解(热降解、光降解)、化学降解和生物降解。微生物修复技术是一种原位生物修复技术，具有安全温和、效率高、效果好、费用低、无二次污染等多个优点，适合大面积面源污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。而且抗/降解除草剂转基因技术是解决除草剂药害的有效途径，而抗除草剂和降解除草剂的基因一般来自微生物降解基因。

麦草畏(dicamba)(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，又名百草敌)是60年代由诺华(现在的先正达)开发的激素类除草剂，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果。麦草畏用于苗后喷雾，药剂被被植株吸收、传导，多集中在分生组织及代谢活动旺盛的部位，阻碍植物激素的正常活动，从而使其死亡，能防除200多种杂草，广泛应用于玉米、高粱和小麦等农田杂草防治，目前全球使用量达1.5万吨。麦草畏具有广谱高效、低毒和杂草抗性产生慢等优点，可有效杀死草甘膦抗性杂草，是美国孟山都生物技术公司研发的新一代抗除草剂转基因作物的靶标除草剂。孟山都公司利用麦草畏脱甲基酶基因dmo构建了抗除草剂转基因大豆和棉花，2015年进入商业化阶段，可以预见，随着抗麦草畏转基因作物的商业化推广，麦草畏的使用量会大幅度提高。麦草畏在土壤中稳定，一般能保持40天以上，其在环境中的降解的主力军是微生物，目前已筛选到多种麦草畏的降解菌株，克隆到多个麦草畏降解基因，但是关于麦草畏的微生物降解中间产物3,6-二氯龙胆酸的进一步降解机制，降解基因和酶，目前还没有报道，这严重制约了对麦草畏的环境行为和生态安全方面的研究。因此有必要深入研究麦草畏的微生物代谢的完整降解途径，降解机制，这对研究麦草畏在环境迁移、转化和降解等环境行为及生态安全性具有重要的指导价值。

3,6-二氯龙胆酸(3,6-DCGA)是麦草畏微生物代谢过程中的中间产物，是氯代芳香化合物，脱氯反应一般为脱毒反应，因此3,6-二氯龙胆酸脱氯酶基因和酶的鉴定具有非常重要的应用价值。在治理农药残留中主要具有以下作用，(一)通过现代生物工程技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，(二)通过现代微生物发酵技术将脱氯酶DsmH1和DsmH2制成酶制剂，实现土壤原位修复。综上所述，开展麦草畏降解过程中的降解基因、酶的研究具有非常重要的理论和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有麦草畏微生物降解机制研究的缺乏，提供3,6-二氯龙胆酸脱氯酶基因，该基因参与麦草畏下游降解路径，麦草畏脱甲基生成3,6-二氯水杨酸(3,6-DCSA)，然后3,6-DCSA 5-羟基化生成3,6-二氯龙胆酸(3,6-DCGA)，本发明脱氯酶DsmH2能将3,6-二氯龙胆酸6号位置的氯离子脱去生成3-氯龙胆酸，代谢途径见图1。本发明的另一目的是提供该3,6-二氯龙胆酸脱氯酶基因编码的蛋白DsmH2。DsmH2是首次发现参与麦草畏下游代谢路径的依赖GSH的谷胱甘肽硫转移酶类型的还原脱氯酶。本发明的又一目的是提供基因dsmH2及其编码蛋白的应用。

发明内容

本发明的目的可通过以下技术方案实现：