[发明专利]BTV-10型、20型、23型基因型分型的多重RT-PCR试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.BTV-10型、20型、23型基因型分型的多重RT-PCR试剂盒，其特征是：包括Mix Primer管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，所述Mix Primer管由以下引物组成：

DNA序列为SEQ ID NO.1的20μmol/L的BTV-10上游引物1μL；

DNA序列为SEQ ID NO.2的20μmol/L的BTV-10下游引物1μL；

DNA序列为SEQ ID NO.3的20μmol/L的BTV-20上游引物0.2μL；

DNA序列为SEQ ID NO.4的20μmol/L的BTV-20下游引物0.2μL；

DNA序列为SEQ ID NO.5的20μmol/L的BTV-23上游引物0.2μL；

DNA序列为SEQ ID NO.6的20μmol/L的BTV-23下游引物0.2μL；

合计2.8μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管：管内为BTV-10、BTV-20、BTV-23阳性重组质粒混合物；

所述阴性对照管：管内为无BTV-10、BTV-20、BTV-23牛肉肌肉组织DNA样品；

所述灭菌去离子水管：500μL。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述阳性重组质粒由如下步骤获得：分别以如下引物组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，按常规RT-PCR扩增，分别将PCR目的产物与PMD19-T载体进行连接，转化到DH5α后扩大培养提取质粒，并PCR鉴定、测序和NCBI-BLAST比对获得。

3.根据权利要求1或2所述述试剂盒，其特征在于：将BTV-10、BTV-20、BTV-23置于同一PCR反应管中进行特异性扩增，根据扩增片段的大小，将这3种基因型进行鉴别与区分。

4.利用权利要求1或2或3所述试剂盒进行BTV-10、BTV-20、BTV-23多重RT-PCR非疾病诊断目的的检测方法：包括如下步骤：

(1)待测样品模板制备：按照商品化病毒RNA提取试剂盒提取待测样品全基因组，获得待测模板；

(2)PCR扩增反应体系：TaKaRa PrimeScript^TM One Step RT-PCR kit中的2X 1stepBuffer 12.5μL，primeScript 1step Enzyme Mix 1μL，本试剂盒中的Mix Primer 2.8μL，灭菌去离子水5.7μL，待检模板或阳性对照或阴性对照3μL，反应总体积为25μL；

(3)PCR扩增反应条件：50℃30min，94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min；

(4)结果判定：PCR产物经2％琼脂糖凝胶100V 40min电泳后，阳性对照在293bp、356bp、696bp处出现3条带，分别为为BTV-20、BTV-23、BTV-10，阴性对照无条带出现，样品在阳性对照位置相同的位置出现条带则判定为该基因型阳性，无条带出现则判定为该基因型阴性；阳性质控未出现目的条带或阴性对照出现条带，则结果无效。