[发明专利]一种利用共固定化酶体系制备葡萄糖酸的方法

权利要求书

1.一种利用共固定化酶体系制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，它包括玉米秸秆预处理，共固定化酶的制备，共固定化酶催化秸秆木质纤维素转化葡萄糖酸等步骤。

2.如权利要求1所述的一种利用共固定化酶体系制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述玉米秸秆预处理是首先将1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐配置成质量分数为0.4～0.6％的1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液，待用；另取玉米秸秆进行粉碎过80～100目筛，得玉米秸秆粉末，待用；然后将1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液置于适宜容器中，加入玉米秸秆粉末，置于水浴锅中于温度80～100℃温度下加热1～2小时，加热完毕，取出用锡箔纸封住容器口，放冷至室温，然后加入二甲基亚砜，置于离心机中设置转速8000～10000r/min，离心3～5分钟，分别收集离心沉淀和上清液，待用；取上述离心沉淀，用沉淀10倍沉淀体积的二甲基亚砜洗涤3次，然后用去离子水洗涤沉淀至洗涤液澄清，即得纤维素材料1；另取上述收集的上清液，加入与上清液等体积的丙酮与水的混合溶液，静置1～3小时，再用0.45μm滤膜过滤，收集沉淀，再用去离子水洗涤至洗涤液澄清，即得纤维素材料2；合并上述制得的纤维素材料1和纤维素材料2，置于鼓风干燥箱中，设置温度70～80℃，干燥4～6小时，预处理结束，备用。

3.如权利要求2所述的一种利用共固定化酶体系制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，玉米秸秆预处理步骤中所述玉米秸秆粉末与1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液的质量体积比为1:35～50，所述放冷至室温后加入二甲基亚砜的用量为1-烯丙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液的0.5倍，所述丙酮与水的混合溶液中水与丙酮的体积比为1:1。

4.如权利要求3所述的一种利用共固定化酶体系制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述共固定化酶的制备，是取活化后的Eudragit L-100置于适宜容器中，加入pH5.8～6.2的柠檬酸缓冲液稀释至Eudragit L-100的质量百分浓度为0.4～0.6％，得Eudragit L-100载体溶液；取Eudragit L-100载体溶液4～6ml置于适宜容器中，然后加入8～12mg二亚胺盐酸盐，搅拌30～50min，搅拌转速为140～160r/min，搅拌结束后，分别加入16～20U的纤维素酶、1～1.5U的葡萄糖氧化酶、35～38U的过氧化氢酶，混合均匀得混合溶液，将混合溶液置于温度28～32℃的恒温振荡筛振荡2～3小时，振荡结束，加入3mol/L盐酸调节溶液pH为3.8～4.2，室温静置20～30min，然后于离心机中离心，离心结束收集沉淀，用pH4.0的柠檬酸缓冲液于振荡筛中震荡洗涤3次，每次5min，洗涤完毕，滤过，收集沉淀得固态固定化酶，然后将制得的固定化酶溶解在pH6.0柠檬酸缓冲液中，得到溶解状态的固定化酶。

5.如权利要求4所述的一种利用共固定化酶体系制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，其中共固定化酶的制备中所述振荡器的转速为150r/min；所述离心机的转速为7500～8500r/min，离心时间为10～15min。

6.如权利要求5所述的一种利用共固定化酶体系制备葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述共固定化酶催化秸秆木质纤维素转化葡萄糖酸是取预处理后的玉米秸秆0.2～0.3g置于适宜容器中，加入pH5.5的柠檬酸缓冲液和去离子水各1.8～2.1ml，然后置于高压灭菌锅中设置灭菌温度121℃，灭菌时间30min，灭菌结束后，取出放置室温，然后加入1.5～2.0U溶解状态固定化酶，置于55～60℃温度环境下放置45～50小时，反应完成，加入1mol/LNaOH溶液1ml，离心分离，采用高效液相色谱法检测上清液中葡萄糖酸的含量；离心分离后，离心沉淀即为不溶性纤维底物，上清液中含溶解性共固定化酶，离心分离后收集上清液，以0.1mol/L盐酸调节上清液溶液pH至3.8～4.2，共固化酶沉淀析出，再次离心，沉淀即为回收的共固定酶，上清液即为葡萄糖酸溶液；其中所述pH5.5的柠檬酸缓冲液和去离子水的总体积需小于4ml。