[发明专利]鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物、试剂盒及应用

权利要求书

1.鉴定三七成分的环介导等温扩增引物，其特征在于，包括外部引物对、内部引物对和环引物对；

所述的外部引物对的序列为：

上游外部引物F3:atacgattagcaatgtcctcc；

下游外部引物B3:ccttgttgtgagctggtg；

所述的内部引物对的序列为：

上游内部引物FIP:cagtgggcggatcaaagtacaacttgtcacggtccttaacc；

下游内部引物BIP:aggcataaccagcattggcattgtggatggaactcaacg；

所述的环引物对的序列为：

上游环引物LF:tgttgtggacgtatggcaa；

下游环引物LB:cccaagctcaatgcttcaag。

2.含有权利要求1所述扩增引物的鉴定三七成分的试剂盒。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阳性对照模板、阴性对照模板和PCR反应浓缩液；

所述的阳性对照模板为三七的基因组DNA；

所述的阴性对照模板为其他植物的基因组DNA。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照模板为三七根部的基因组DNA。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照模板为水三七的基因组DNA或莪术的基因组DNA。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其扩增体系为：

模板 4μL，

上游外部引物F3 5uM 1μL，

下游外部引物B3 5uM 1μL，

上游内部引物FIP 40uM 1μL，

下游内部引物BIP 40uM 1μL，

上游环引物LF 20uM 1μL，

下游环引物LB 20uM 1μL，

PCR反应浓缩液 15ul，

总计25μL。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序为：扩增程序：65℃扩增30min；溶解程序：98-80℃，0.05℃为一个循环。

8.权利要求1所述扩增引物在鉴别三七真伪中的应用。

9.权利要求2-7任意一项所述试剂盒在鉴别三七真伪中的应用。

10.鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法，采用权利要求2-7任意一项所述试剂盒或者权利要求1所述扩增引物，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），使用植物基因组提取试剂盒提取样本DNA；

步骤（2），分别以阳性对照模板、阴性对照模板、待检测样本DNA作为模板进行制备如下扩增体系：

模板 4μL，

上游外部引物F3 5uM 1μL，

下游外部引物B3 5uM 1μL，

上游内部引物FIP 40uM 1μL，

下游内部引物BIP 40uM 1μL，

上游环引物LF 20uM 1μL，

下游环引物LB 20uM 1μL，

PCR反应浓缩液 15ul，

总计25μL；

步骤（3），将上述制备好的扩增体系进行PCR反应；设置扩增程序：65℃扩增30min；溶解程序：98-80℃，0.05℃为一个循环，做扩增曲线和溶解曲线；

步骤（4），根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定：

若扩增曲线有明显的“S”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果，说明样品中含有三七；

扩增曲线没有出现明显“S”型曲线，则判定为阴性结果，说明样品中不含有三七；

扩增曲线有明显“S”型曲线，但溶解曲线峰型不单一判定为非特异性扩增，则需重复步骤（1）-步骤（3），之后再次按照上述判定方法进行判定；

阳性对照模板的检测结果是阳性结果，阴性对照模板的检测结果是阴性结果，则是说明实验有效，否则实验无效。