[发明专利]转基因水稻GRH和黑金米的培育及GRH目的基因的检测方法

权利要求书

1.利用GRH为亲本培育黑金米的方法，包括以下步骤：

1）PCR筛选所述GRH的后代植株中psy和crtI显性纯合的植株与黑米杂交，得到F1代；所述的黑米品种为黑帅；

2）以所述黑米为轮回亲本与F1代进行回交，得到BC3F1代；

3）将所述BC3F1代自交挑选psy和crtI显性纯合的后代植株后得到黑金米；

所述GRH的培育方法，包括以下步骤：

①将目的基因转入含双T-DNA区的表达载体中，获得最终表达载体，所述双T-DNA区包括第一T-DNA区和第二T-DNA区，所述第一T-DNA区连接有hpt标记基因，所述第二T-DNA区连接目的基因；所述目的基因为八氢番茄红素合酶基因psy和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；所述八氢番茄红素合酶基因psy的5’端修饰有谷蛋白启动子和Hind III酶切位点，3’端修饰有nos终止子和Sal I酶切位点，修饰后的八氢番茄红素合酶基因psy的核苷酸序列如SEQID NO:17所示；

所述八氢番茄红素脱氢酶基因crtI的5’端修饰有谷蛋白启动子和EcoR I酶切位点，3’端修饰有nos终止子和Kpn I酶切位点，修饰后的八氢番茄红素脱氢酶基因crtI的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；

所述含双T-DNA区的表达载体是在表达载体pCAMBIA1300的基础上改造获得的；

②利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述最终表达载体转化入粳稻品种空育131中，获得T0代转化植株；

③利用PCR筛选所述T0代转化植株中psy、crtI和hpt均表现阳性的植株，进行自交结实，获得T1代转化植株；

④筛选所述T1代转化植株中无hpt表达的植株，得到转基因粳稻品种，命名为GRH；

步骤①所述含双T-DNA区的表达载体的构建方法包括以下步骤：

a）利用Bst XI 和Xho I双酶切表达载体pCAMBIA1300，去除CaMV 35S启动子和hpt基因的编码区区段，得到包含第二T-DNA区的中间载体pMF；

b）利用Sac I和Hind III双酶切表达载体pCAMBIA1300，去除多克隆位点区段，得到中间载体pC1300E；

c）向步骤b）得到的所述中间载体pC1300E在Sph I酶切位点靠近EcoR I一侧引入SacII酶切位点，构建中间载体pC1300ES；

d）去除步骤c）得到的所述中间载体pC1300ES的EcoR I酶切位点，得到中间载体pC1300NES；

e)用Sac II酶切步骤d）得到的所述中间载体pC1300NES，得到携带hpt的第一T-DNA区片段；

f)将步骤a）得到的所述包含第二T-DNA区的中间载体pMF与步骤e)得到的所述携带hpt的第一T-DNA区片段连接，得到含双T-DNA区的表达载体；

所述步骤a）分别与步骤b）、c）、d）和e）之间没有时间先后顺序的限制；

步骤③所述PCR筛选用的引物序列如SEQ ID NO:1~6所示。