[发明专利]一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种血浆miRNA的qRT‑PCR检测方法，包括如下步骤：标本收集、滴加miRNA提取液、滴加氯仿、第一次离心、移液、滴加miRNA提取液和异丙醇、第二次离心、滴加乙醇、第三次离心、滴加RNase‑free水、配置加尾及逆转录反应体系、配置荧光定量PCR反应体系、进行定量检测、读取和记录数据和数据分析；本发明可以检测处血浆中的miRNA的各项参数，目前对miRNA参与这些复杂的基因调控和多种疾病的传导通路的具体机制还不太清楚，因此准确预测miRNA的靶基因并且对靶基因的传导通路进行系统的生物学分析也是研究其作用机制的重要环节，生物信息学分析可以有效的对miRNA靶基因进行预测并对其调控网络进行构建，为miRNA用于疾病的诊断提供理论依据。

技术领域

本发明涉及医疗检测技术领域，具体为一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法。

背景技术

结直肠癌在我国的发病率高居肿瘤排行榜第五位，其死亡率也一直居高不下，已成为威胁我国公众健康及生命的主要疾病之一，且目前有统计表明，近年来结直肠癌的发病率仍呈逐步升高的趋势，其早、晚期五年生存率存在巨大差距，转移性结直肠癌的五年生存率不足13％，而早期结直肠癌五年生存率可达90％以上，但由于缺乏有效的早期诊断指标和手段，其早期诊断率仍不足结直肠癌诊断的40％，大多数结直肠癌患者入院时已是晚期，错过了最佳治疗的黄金时期。

目前结直肠癌的诊断主要依靠结肠镜检查及活体组织病理检查，但由于其花费高并伴随一定的检查痛苦与风险以及由于检查医师技术问题，如肠道准备不全、退镜速度过快等，存在一定漏诊率，难以达到普查要求。CT、MRI等影像学检查由于对结直肠微小病变难以做到早期诊断，并不足以满足临床要求。目前临床常用的粪便隐血试验及肿瘤标志物如CEA等，由于敏感性和特异性不足，不能有效的对结直肠癌进行筛查与早期诊断。寻找一种可用于结直肠癌早期诊断的花费低、创伤小的新型肿瘤标志物已成为一大热点。越来越多研究证明miRNA与肿瘤的发生发展及预后等存在密切关系，有望成为临床肿瘤的一种新型标志物。

所以，如何设计一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，成为我们当前要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，包括如下步骤：

1)标本收集：使用5mlEDTA真空采血管抽取空腹静脉血4ml，采血后轻轻颠倒试管，混合8-10次，不得剧烈震荡，采完血样后样本垂直放置，使用台式低俗低温离心机3500rpm离心10min分离得到血浆，样本无肉眼可见溶血，剔除所有溶血可能的血浆样本，每200μL分装到一个冻存管，随后存放于-80℃冰箱待用，尽量减少冻融次数，全程需在抽血后2小时内完成；

2)滴加miRNA提取液：100μl血浆里加入1ml miRNA提取液，反复吹打至析出物完全溶解；

3)滴加氯仿：加入200μl氯仿，盖紧EP管管盖，剧烈振荡20秒，室温静置5分钟；

4)第一次离心：冷冻离心机12000g，4℃条件下离心15分钟，此时匀浆液分为三层：上层为含miRNA上清液，中间为白色蛋白层，下层为有色有机相；

5)移液：吸取500μl上清液转移到新的EP管中；

6)滴加miRNA提取液和异丙醇：加入5μl miRNA提取液和等体积的异丙醇(505μl)，上下颠倒充分混匀，-20℃静置10分钟；

7)第二次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心10分钟；

8)滴加乙醇：弃上清，向沉淀加入1ml75％乙醇，轻缓颠倒清洗沉淀；