[发明专利]一种三维类器官的液滴培养方法

权利要求书

1.一种三维类器官的液滴培养方法，其特征在于：所述液滴培养方法包括下述步骤：

（1）取100μl标准移液枪头，用剪刀将所述标准移液枪头在距其尖端5-11mm的位置平齐截断，将截面打磨光滑平整，90℃消毒灭菌30min后备用；

（2）将小鼠胚胎3T3成纤维细胞与待培养的类器官细胞分别培养至生长旺盛期，待其均铺满细胞培养瓶后，分别加入Trypsin将3T3成纤维细胞与待培养的类器官细胞消化1min，随后加入新鲜DMEM培养液终止消化并用移液枪将细胞轻轻吹打到DMEM培养液中，将所得DMEM培养液800r/min离心5min收集细胞，然后向所收集的细胞中加入新鲜DMEM培养液并吹打成细胞悬浮液，将细胞浓度均控制为10⁶个/ml，并按照1﹕1的细胞数量比例将两者混合均匀，即得到3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液；

（3）将上述经过处理的移液枪头尖端向下竖直放置，从其上端向其中注入40-100μl的所述3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液，细胞混合液在重力作用下向移液枪头下端移动，并通过液体表面张力在移液枪头下端形成液滴，该液滴的下凹液面即为细胞的生长附着基底层，细胞堆积在液滴的下凹液面上，形成三维组织，在水接触角仪下观察移液枪头下端所形成的液滴与移液枪头截面间的接触角，并将液滴与截面间的接触角角度控制在26°-33°；

（4）将上述载有细胞混合液的移液枪头放入细胞培养箱内培养一周，培养箱温度控制为37℃，二氧化碳浓度控制为5%，每间隔一天用移液枪吸出一半上清培养液，同时加入等体积新鲜的DMEM培养液，具有球形形态、结构致密的类器官组织在培养的第三天开始形成，培养一周后即获得毫米级的三维类器官。

2.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，其特征在于第（3）步骤中将液滴与截面间的接触角角度控制为30°。

3.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，其特征在于第（3）步骤中从移液枪头上端向其中注入50-80μl的3T3成纤维细胞-待培养类器官细胞混合液。

4.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，其特征在于所述待培养的类器官细胞为人体肿瘤细胞。

5.如权利要求4所述的三维类器官的液滴培养方法，其中所述人体肿瘤细胞为人肝肿瘤HepG2细胞。

6.如权利要求1所述的三维类器官的液滴培养方法，包括下述步骤：

（1）取100μl标准移液枪头，用剪刀将所述标准移液枪头在距其尖端8mm的位置平齐截断，将截面打磨光滑平整，90℃消毒灭菌30min后备用；

（2）将小鼠胚胎3T3成纤维细胞与人肝肿瘤HepG2细胞分别培养至生长旺盛期，待其均铺满细胞培养瓶后，分别加入Trypsin将3T3成纤维细胞与HepG2细胞消化1min，随后加入新鲜DMEM培养液终止消化并用移液枪将细胞轻轻吹打到DMEM培养液中，将所得DMEM培养液800r/min离心5min收集细胞，然后向所收集的细胞中加入新鲜DMEM培养液并吹打成细胞悬浮液，将细胞浓度均控制为10⁶个/ml，并按照1﹕1的细胞数量比例将两者混合均匀，即得到3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液；

（3）将上述经过处理的移液枪头尖端向下竖直放置，从其上端向其中注入80μl的所述3T3成纤维细胞-HepG2细胞混合液，细胞混合液在重力作用下向移液枪头下端移动，并通过液体表面张力在移液枪头下端形成液滴，该液滴的下凹液面即为细胞的生长附着基底层，细胞堆积在液滴的下凹液面上，形成三维组织，在水接触角仪下观察移液枪头下端所形成的液滴与移液枪头截面间的接触角，并将液滴与截面间的接触角角度控制为30°；

（4）将上述载有细胞混合液的移液枪头放入细胞培养箱内培养一周，培养箱温度控制为37℃，二氧化碳浓度控制为5%，每间隔一天用移液枪吸出一半上清培养液，同时加入等体积新鲜的DMEM培养液，具有球形形态、结构致密的肝脏类器官组织在培养的第三天开始形成，培养一周后即获得毫米级的三维肝脏类器官。