[发明专利]一种肠道微生物基因组DNA的提取方法

说明书

本发明是一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，具体步骤为：(1)粪菌样本采集；(2)菌体获得；(3)粪菌基因组DNA提取和纯化。本发明减少了有机溶剂的使用，成本低廉且提取的微生物总DNA纯度较高；异硫氰酸胍可以迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酶，得到的DNA质量高；能得到更加丰富的DNA种群信息，可更加全面地反映肠道微生物的多样性和群落结构组成，操作步骤较少，稳定性好，是一种实用可靠的粪便微生物DNA提取方法，可广泛应用于肠道微生态的研究。

技术领域

本发明涉及肠道微生物的科学研究、临床诊断、药物开发等相关领域，尤其涉及一种肠道微生物基因组DNA的提取方法。

背景技术

肠道内定植了数量众多、种类丰富的肠道菌群，它们和宿主间形成了互利共生的关系，对宿主的健康产生着重大影响.近年来，随着对肠道菌群调控作用研究的不断深入，发现肠道菌群不仅调控肠道活动，还影响宿主的脑功能和行为.因此人体的生理健康除受自身基因的调控外，还受到肠道菌群的影响。人体肠道内的细菌有1000-1150种，其中160种为优势菌种，存在不同类型的生态学相互作用。肠道细菌的300多万个基因被视为人类的“第二基因组”，在正常人体健康状态下，肠道微生物种群处于平衡状态，而在宿主患病期，菌群失调或紊乱。

近年来，随着高通量测序技术的不断发展及成熟，该技术在探究及鉴定环境微生物群落中也得到了广泛的应用，这种方法突破了微生物分离培养的限制，能够全面分析自然界的微生物类群及充分挖掘基因资源。然而，对于这种基于核酸的分子生物学技术，DNA提取质量的好坏会直接影响到微生物群落结构的分析结果。所以，肠道菌群的DNA提取是实验研究至关重要的一步。因肠道微生物基因组研究有着其特殊性，粪便成分复杂，并受到各种因素的影响，得到的基因组DNA纯度不高，导致下游实验如基因组测序数据的不稳定。近些年来，国内外相关机构对肠道菌群基因组DNA提取方法进行了比较和评估，发现现有的方法存在很多问题，比如一些未被消化的食物残渣、多糖、脲以及消化酶，其中有的成分会影响到后续的PCR分析，DNA提取效率普遍偏低，且稳定性差。因此怎样有效地排除这些物质的干扰成为提取高质量粪便总DNA的关键。

发明内容

本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，用于肠道微生物基因组的DNA提取，为下游基因组DNA的检测和分析提供可靠的样本基础。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种肠道微生物基因组DNA的提取方法，具体步骤为：

(1)粪菌样本采集

对离心管进行灭菌处理；

取样时手带一次性无菌手套，持灭菌后的离心管，探入粪便排泄物中，打开离心管盖，将粪便样本装入离心管中，离心管充满后立刻盖严，并迅速取出，做好标记和记录，直接投入干冰中冻存，之后置于-80℃的环境中保存；

(2)菌体获得

取粪菌样品，然后向粪菌样品中加入经4℃预冷的PBS缓冲液，其中，加入的比例为每3克粪菌中加入10ml的PBS缓冲液，待样品融化后涡旋振荡1min，然后在4℃下采用1000r/min的速度离心5min，吸取上清液；样品重复震荡、离心、取上清液三次；

将四次融化洗涤后所得上清液在4℃下采用12000r/min的速度离心10min，弃掉离心管上层清液，向每管底部沉淀均加入TE缓冲液，其中，TE缓冲液的体积与之前加入的PBS缓冲液的体积比为100：17；混匀后吸取液体至同一个灭菌离心管中，充分震荡混匀，形成细胞悬液；

(3)粪菌基因组DNA提取和纯化

取细胞悬液置于无菌管中加入经4℃预冷的PBS缓冲液，其中细胞悬液、PBS缓冲液的体积比为1：50；