[发明专利]一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

病毒抽提缓冲液；PBST缓冲液；包被缓冲液；夜来香花叶病毒特异性抗体；正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RT Buffer；RNA酶抑制因子；反转录酶；dNTPs；PCR Mix；夜来香花叶病毒阳性对照样品；阴性对照样品；RNase-free ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和反向引物的浓度独立地为10μmol/L。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA酶抑制因子的浓度为40U/μL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录酶的浓度为200U/μL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的浓度为10mmol/L。

6.基于权利要求1～5所述试剂盒的夜来香花叶病毒分子检测方法，包括以下步骤：

1)将检测样品与病毒抽提缓冲液按质量体积比1g:10mL混合，得到样品提取液；

2)将用包被缓冲液稀释500倍的夜来香花叶病毒特异性抗体溶液加入PCR管中，37℃孵育2h后，倒去夜来香花叶病毒特异性抗体溶液，用PBST缓冲液清洗，将步骤1)得到的样品提取液加入PCR管中，4℃包被过夜，得到免疫捕获病毒的PCR管；

3)清洗步骤2)得到的免疫捕获病毒的PCR管后，进行反转录，得到cDNA，所述反转录为：在免疫捕获病毒的PCR管中加入RNase-free ddH₂O和反向引物，72℃水浴10min后冰浴5min；再加入RT Buffer、dNTPs、RNA酶抑制因子、反转录酶，42℃水浴60min，72℃水浴10min；

4)将所述步骤3)得到的cDNA进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；

5)将所述步骤4)得到的PCR反应产物进行电泳检测，若在847bp处出现DNA条带，则所述检测样品含有夜来香花叶病毒。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述混合后还包括研磨和离心的过程，所述离心后取上清液。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述离心的条件为4℃，10000g离心10min。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤3)所述清洗为：采用PBST缓冲液清洗3次后，再用RNase-free ddH₂O洗管2次。

10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤5)所述电泳检测采用1.5％的琼脂糖凝胶进行。