[发明专利]一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法

权利要求书

1.一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，包括有以下步骤，具体的：

a、病毒株的培养与扩增：RV-Wa株与SA-11病毒株的培养与扩增均在猴胚胎肾细胞上进行；

b、制备GST-NSP4_T融合蛋白；

c、构建RV腹泻模型以及NSP4腹泻模型：动物接种病毒及给药，空白组灌胃DMEM培养液，200µl/只；RV组灌胃SA-11株200µl/只，NSP4_T组腹腔注射重组融合蛋白GST-NSP4_T，200µl/只，乳鼠灌胃后与母鼠同笼，母乳喂养；1dpi后，腹泻乳鼠分别灌胃给药，RV组、NSP4_T病毒对照组及空白组灌胃DMEM培养液200µl/只，每天三次，连续5天；

d、体重、体征、腹泻程度观察及粪便RV含量测定；

e、动物取材：在给药后第1、2、3、4、5天相同时间点处死乳鼠，且每组3只，取每只乳鼠小肠、大肠组织，经PBS冲洗后放入含RNAlater溶液中浸泡24h，装入灭活RNA酶的冻存管内，于液氮冷冻并于-80℃保存，以用于分子生物学检测；一份10%甲醛固定，供免疫组织化学及常规HE染色；

f、相关指标检测：在RV感染后每时间点取各肠段石蜡切片HE染色，光镜观察形态学改变、TUNEL荧光显色法原位检测肠上皮细胞凋亡。

2.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于：于所述步骤a中，接种RV-Wa株的猴胚胎肾细胞在接种前需经胰酶活化，当细胞出现严重的细胞病变后，保存细胞瓶于-20℃冰箱过夜，次日4℃溶解，反复冻融三次后，收集细胞冻融液，离心，分装，冰箱保存备用。

3.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：各肠段组织，用4mL TEN溶液充分吹悬沉淀后，常规方法滴膜，2%磷钨酸负染后电镜观察细胞形态。

4.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：免疫组织化学方法和荧光检测9种NHEs表达和定位。

5.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：qRT-PCR检测各肠断组织中CaSR mRNA的表达。

6.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：Western blot 检测各肠断组织中CaSR蛋白表达。

7.根据权利要求1所述的一种CaSR在RV、NSP4感染后的表达水平分析方法，其特征在于，所述步骤f中还包括有：Fura-2/AM检测细胞内[Ca²⁺]_i变化。