[发明专利]一种密码子优化的重组人溶菌酶基因及其应用

说明书

本发明涉及一种密码子优化的重组人溶菌酶基因及其应用，该密码子优化的重组人溶菌酶基因是通过比较牛乳腺优势乳蛋白高频密码子和低频密码子对人溶菌酶密码子进行全局优化(Lyzop)和翻译起始后23位密码子进行优化(Lyzop23)。优化后的密码子显著提高了人溶菌酶mRNA稳定性及在牛乳腺细胞中mRNA表达量。通过蛋白免疫印迹实验证明，密码子优化的重组人溶菌酶基因在牛乳腺细胞中表达量是野生型的2.18倍。为今后细胞生物反应器以及牛乳腺生物反应器高效生产重组人溶菌酶提供了工具基因。同时，将密码子优化的重组人溶菌酶基因与荧光素酶融合表达，通过分析荧光素酶表达量，实现密码子优化效果的快速、准确评价，为今后开展基因密码子优化提供了新的可靠评价方法。

技术领域

本发明属于分子生物学、细胞工程技术领域，具体地涉及一种密码子优化的重组人溶菌酶基因及其应用。

背景技术

溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶，具有广谱抗菌、消炎、抗病毒等多种功效。人溶菌酶作为天然蛋白，在人体内体液、细胞及组织器官中广泛分布，发挥重要抗菌、抗病毒、调节机体免疫等作用。目前，人溶菌酶在临床疾病治疗、乳制品添加剂、食品防腐等方面具有广泛应用。然而，传统方法从母乳、胎盘或尿液分离提取很难达到工业化生产要求。利用细胞生物反应器或乳腺生物反应器相比细菌、酵母等生物反应器具有稳定性好，重组蛋白活性高等优点，但普遍存在着重组人溶菌酶表达量低的问题，不利于下一步工业化生产。

组成蛋白质的氨基酸有20种，而编码氨基酸的密码子有64种，每个氨基酸至少对应1种密码子，最多可以有一种氨基酸对应6种密码子(简并密码子)。不同生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其中使用频率高密码子称为最佳密码子(optimal codons)，而那些很少被利用的密码子称为稀有或低频密码子。在生物反应器研究过程中，外源基因含有宿主细胞基因使用的低频密码子或者偏好密码子不一致情况下，往往会影响外源基因的mRNA的稳定性和翻译效率，造成重组蛋白表达量低。前期研究结果发现，重组人溶菌酶在转基因羊、牛乳腺生物反应器中表达量相比其他重组乳蛋白表达均不理想，造成后续提纯生产成本高。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种密码子优化的重组人溶菌酶基因，以及利用该密码子优化的重组人溶菌酶基因在乳腺生物反应器的应用。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种密码子优化的重组人溶菌酶基因，其特征在于，该密码子优化的重组人溶菌酶基因是Lyzop和Lyzop23，它们的核苷酸序列为：

GCCTAGCAAACTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCTGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTTGTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTGTAA；

其中，斜体加粗部分表示重组人溶菌酶基因按照牛乳蛋白偏好密码子进行设计优化后的密码子。

根据申请人的实验表明，上述密码子优化的重组人溶菌酶基因能够在乳腺生物反应器的应用。

进一步地，所述的密码子优化的重组人溶菌酶基因与PGL3-control载体经NcoI酶切位点连接实现与荧光素酶融合的表达载体。

所述的密码子优化的重组人溶菌酶基因与荧光素酶融合评估密码子优化效果。