[发明专利]抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆球蛋白酶解产物的制备方法

权利要求书

1.抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆球蛋白酶解产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备新疆黑蜂蜂王浆冻干粉；

在步骤(1)中新疆黑蜂蜂王浆冻干粉制备方法如下：

取新鲜黑蜂蜂王浆，用分析天平称重后，放入离心管中，然后将放有新鲜黑蜂蜂王浆的离心管置于-75～-85℃冰箱中，待新鲜黑蜂蜂王浆完全冻结后，用真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得新疆黑蜂蜂王浆冻干粉；

(2)脱脂和制备蜂王浆主蛋白；

在步骤(2)中，采用一步法脱脂和制备水溶性总蛋白，具体步骤如下：

在蒸馏水中依次加入双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷和N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，使双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷的浓度为0.3～0.5g/L、N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为0.1～0.2g/L，搅拌，调节溶液的pH为7，即得蜂王浆活化提取液；然后向蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉，搅拌活化0.5～1h，再加入石油醚，每升蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉4～7g，石油醚与蜂王浆活化提取液的体积比为1:1.5～2；振荡0.5～1h，过滤，滤渣为球蛋白制备原料；滤液静置分层，除去有机相；将水相用14K透析膜进行透析后，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后即得蜂王浆主蛋白冻干粉；

在步骤(2)中，制备蜂王浆主蛋白的方法如下：

将脱脂蜂王浆溶于蒸馏水中浸提、过滤，再将滤渣用蒸馏水在同样条件下重复浸提三次，然后合并滤液，所得滤液为蜂王浆水溶性总蛋白溶液，将蜂王浆水溶性总蛋白溶液用14K透析膜进行透析后，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后即得蜂王浆主蛋白冻干粉；滤渣为球蛋白制备原料；

(3)制备球蛋白；

在步骤(3)中，在温度为4℃的条件下，将脱脂和制备蜂王浆主蛋白后的滤渣用8～12倍体积的、NaCl浓度为1.5～2.5wt％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为0.3～0.6wt％、pH＝7的溶液溶解，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌0.5～1h，过滤，将滤液用透析膜透析，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结后，真空冷冻干燥机冷冻干燥后所得干粉即为球蛋白；

(4)制备新疆黑蜂蜂王浆球蛋白酶解产物；称取0.2500g球蛋白溶于62.5mL超纯水中后，均分成五份：

第一份用精密酸度计调pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第二份用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第三份用精密酸度计调pH至8.5，加入0.0333g胰凝蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第四份先用精密酸度计调至pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内1h，然后再用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内1h；

第五份先用精密酸度计调pH至2.0，加入0.1000g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内1h，之后用精密酸度计调pH至7.5，再加入0.1000g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内1h，再用精密酸度计将pH调至8.5，最后加入0.1000g胰凝蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入球蛋白批量酶解用实验装置内1h；

酶解结束后将上述五份溶液放置于数显式恒温水浴锅中沸水浴15min，使酶失活；分别用离心机离心，离心力为12000xg，在4℃下离心10min后得到酶解产物：第一份离心后得到酶解产物命名为胃蛋白酶酶解产物、第二份离心后得到酶解产物命名为胰蛋白酶酶解产物、第三份离心后得到酶解产物命名为胰凝蛋白酶酶解产物、第四份离心后得到酶解产物命名为胃+胰蛋白酶酶解产物、第五份离心后得到酶解产物命名为胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物；

将上述得到的酶解产物胃蛋白酶酶解产物、胰蛋白酶酶解产物、胰凝蛋白酶酶解产物、胃+胰蛋白酶酶解产物和胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物，用截留分子量为10kD和3kD的超滤管或截留分子量为10kD和3kD的蜂王浆酶解产物超滤装置进行超滤分离得到大于10kD的肽段、3kD-10kD的肽段、以及小于3kD的肽段；

(5)分离球蛋白酶解产物中不同分子量肽段；