[发明专利]混合型热启动DNA聚合酶组合物、PCR扩增试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种混合型热启动DNA聚合酶组合物、PCR扩增试剂盒及其应用，Taq DNA聚合酶、抗Taq抗体和突变型KOD DNA聚合酶，其中，抗Taq抗体能够与Taq DNA聚合酶特异性结合，突变型KOD DNA聚合酶与野生型KOD DNA聚合酶相比第147位的组氨酸突变为赖氨酸。实验结果表明，上述混合型热启动DNA聚合酶组合物，用于PCR扩增时错配率低，具有高效扩增与高保真性的双重特点，用于扩增时耐热好，无论是对较长的DNA片段还是低模板量的模板或是高GC含量的模板均具有较好扩增效果。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种混合型热启动DNA聚合酶组合物、PCR扩增试剂盒及其应用。

背景技术

PCR扩增(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。其原理是利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合。再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

DNA聚合酶(DNA polymerase)是在复制DNA中起关键作用的酶。DNA聚合酶主要是以DNA为复制模板，将DNA由5’端开始复制到3’端的酶。目前DNA聚合酶大多数是纯化发酵产物得到，或对酶蛋白进行抗体或化学修饰以达到热启动。衡量DNA聚合酶保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。用普通DNA聚合酶对样品进行扩增的错配率一般在10^-5碱基/循环数。对于错配率要求非常严格的实验，如基因筛选、测序、突变检测等，普通DNA聚合酶远远不能满足要求。新出的KOD DNA聚合酶虽然能够在一定程度上降低错配率，然而错配率仍然有待进一步降低，且KOD DNA聚合酶的聚合能力一般较差，对较长片段的目标DNA很难扩增出来。此外，传统的DNA聚合酶对于模板量为1pg以下的扩增模板和GC含量较高扩增模板，扩增效果不好，不符合更高灵敏度和准确性的检测需求。

发明内容

基于此，有必要提供一种对较长片段的目标DNA、或低模板量以及高GC含量的扩增模板均具有较好扩增效果的DNA聚合酶。

此外，还有必要提供一种PCR扩增试剂盒及其应用。

一种混合型热启动DNA聚合酶组合物，包括Taq DNA聚合酶、抗Taq抗体和突变型KOD DNA聚合酶，其中，所述抗Taq抗体能够与所述Taq DNA聚合酶特异性结合，所述突变型KOD DNA聚合酶由野生型KOD DNA聚合酶的第147位的组氨酸突变为赖氨酸得到。

在一个实施方式中，所述突变型KOD DNA聚合酶包括：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或，

(b)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有所述突变型KOD DNA聚合酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

在一个实施方式中，所述Taq DNA聚合酶与所述突变型KOD DNA聚合酶的酶活比为1：10U～320U。

在一个实施方式中，所述Taq DNA聚合酶与所述突变型KOD DNA聚合酶的酶活比为1：80U～160U。

一种PCR扩增试剂盒，包括上述任一项所述的混合型热启动DNA聚合酶组合物。