[发明专利]CRISPR-Cas9靶向敲除人细胞SANIL1基因及其特异性的sgRNA

权利要求书

1.一种CRISPR/Cas9 靶向敲除SANIL1基因及其特异性的sgRNA，其特征在于，首先设计获得特异性靶向SANIL1 基因外显子的sgRNA；其次构建SANIL1基因的sgRNA到病毒载体系统，然后将此质粒或者病毒载体系统转染或者感染人细胞，得到的SANIL1基因敲除细胞株。

2.根据权利要求1所述的特异性靶向SANIL1 基因外显子的sgRNA，其DNA 序列如SEQID NO.1、2、3所示，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列是唯一的。

3.根据权利要求2所述的特异性靶向SANIL1 基因外显子的sgRNA，其引物包括

针对SANIL1基因的靶点位于外显子上的引物对：

SANIL1sgRNAoligo1：如SEQ ID NO.2所示；

SANIL1sgRNAoligo2：如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的构建SANIL1基因的sgRNA到病毒载体系统，是一种靶向敲除SANIL1 基因的CRISPR/Cas9 重组表达病毒载体Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg，其特征在于：含有特异性靶向SANIL1 基因显子的sgRNA 和Cas9 蛋白的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体的骨架载体的序列如序列表中SEQ ID NO ：4所示；

根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9 靶向敲除人SANIL1基因及其特异性的sgRNA，其特征在于包括如下步骤：

(1) 提供sgRNA序列，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列符合5’-N(21)G 的序列排列规则，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列位于基因的外显子，所述sgRNA 在SANIL1 基因上的靶序列位于不同的各种剪切形式的共有外显子上，所述sgRNA 在SANIL1基因上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA 在SANIL1 上的靶位点序列如序列表SEQ ID NO.1、2、3序列所示任意一条，在所述sgRNA 在SANIL1 上的靶位点序列的5’- 端加上ACCG序列 合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo ；获得sgRNA 在SANIL1 上的靶位点序列的互补链，并且在互补链的5’ - 端加上AAAC序列， 合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo ；将合成的1对互补的sgRNA 寡聚核苷酸的Forward oligo 和Reverse oligo 成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6 真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；

(2) 线性化序列如序列表SEQ ID NO.4 所示的Lenti-CRISPRv2质粒；将退火的双链sgRNA 寡聚核苷酸与线性化的携带Cas9 基因的表达载体Lenti-CRISPRv2连接获得携带含相应靶序列的sgRNA 寡聚核苷酸和Cas9 基因的表达载体Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg 质粒，转化感受态细菌并涂Amp+ 平板，挑取单克隆并用通用引物U6 通过测序鉴定出阳性克隆，并对所述阳性克隆摇菌、提取pLenti-U6-SANIL1 gRNA v2.0-CMV-Puro-P2A-3Flag-spCas9质粒；

（3）用所述携带有sgRNA 寡聚核苷酸和Cas9 基因的序列为SEQ ID NO.9的表达载体Lenti-CRISPRv2-hSANIL1sg 质粒、序列为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11 的pLP-VSVG(AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260)包装质粒和包装细胞系，包装细胞系为293TN 细胞；包装出同时携带靶向SANIL1基因的sgRNA 和Cas9 的假型病毒；

（4）使用所述假型病毒感染目的细胞，加puromycin抗性筛选后并进一步培养；

（5）铺单克隆细胞，然后收集单克隆细胞，抽提基因组DNA,以其基因组DNA 为模板扩增包含所述靶序列的基因片段，TA 克隆测序确认SANIL1 基因已经被敲除并获得基因敲除的细胞。

6.根据权利要求1所述的敲除SANIL1基因的细胞株，为人细胞；其特征在于：是人细胞中的SANIL1基因缺失或插入核苷酸得到的细胞株。