[发明专利]一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用

权利要求书

1.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为血清型4型H4L1株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018019。

2.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为血清型5型H5L3株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018020。

3.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌为血清型12型H12L3株，于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2018021。

4.权利要求1-3任一项所述的副猪嗜血杆菌在制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗中的应用。

5.一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，含有经甲醛溶液灭活的副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株及水基免疫佐剂，其中，所述副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株均于2018年01月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为：CCTCC M 2018019，CCTCC M 2018020，CCTCC M 2018021。

6.一种如权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，其特征在于，在1mL副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗中，副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株三种抗原分别含2.0×l0⁹、1.0×10⁹和1.0×10⁹CFU菌体。

7.一种如权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.分别将副猪嗜血杆菌H4L1株、副猪嗜血杆菌H5L3株和副猪嗜血杆菌H12L3株菌种增殖培养，得到副猪嗜血杆菌H4L1株菌液、副猪嗜血杆菌H5L3株菌液和副猪嗜血杆菌H12L3株菌液，并对其进行活菌计数，副猪嗜血杆菌4型H4L1株、5型H5L3株和12型H12L3株的活菌含量分别不少于2.0×10⁹、1.5×10⁹和1.0×10⁹CFU/mL；

b.将副猪嗜血杆菌H4L1株、H5L3株和H12L3株的菌液分别单独灭活，按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，在37℃灭活48小时；

c.用中空纤维超滤器将灭活检验合格的菌液浓缩去除上清，根据灭活前活菌计数结果，使用无菌PBS将H4L1株、H5L3株和H12L3株菌体抗原稀释并调节浓度至7.2×10⁹、3.6×10⁹和3.6×10⁹CFU/mL，并将三种抗原液按1:1:1的比例混合均匀；

d.将抗原液与GEL佐剂混合，搅拌均匀，在终止搅拌前加入硫柳汞溶液充分混匀，最终使疫苗中含灭活前H4L1株活菌数至少为2.0×10⁹CFU/mL，含灭活前H5L3株和H12L3株活菌数均至少为1.0×10⁹CFU/mL。

8.一种如权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的生产方法，其特征在于，在步骤d中，将抗原液与GEL佐剂按照(80％～90％)：(20％～10％)的体积比混合，室温下500～800r/min搅拌0.5～1h，至其混合均匀；按照疫苗总体积的0.01％加入硫柳汞。

9.权利要求5所述的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗在临床上防治副猪嗜血杆菌疾病的应用。