[发明专利]一种人诱导多能干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种人乳齿细胞诱导重编程的方法，包括：

(1)分离乳齿细胞；

(2)培养乳齿细胞；

(3)向乳齿细胞中转入编码Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子的载体；

(4)转入端粒酶RNA，瞬时表达端粒酶；

(5)多能性鉴定。

2.如权利要求1所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(1)包括分离牙髓细胞和牙本质细胞。

3.如权利要求2所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于分离牙髓细胞包括，在牙釉质骨质分界处划出深达牙髓腔的凹槽，分裂牙齿，用小镊子取出牙髓组织至于Hanks液中，同时用Hanks液冲洗牙髓腔合并至含牙髓组织的Hanks液中，酶眼科剪剪碎，加入终浓度2mg/mL的中性蛋白酶II和0.5mg/mL的I型胶原酶处理15min，反复吹打，加入含5％BSA的Hanks液终止反应，过金属网筛得牙髓细胞。

4.如权利要求2所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于将除掉牙髓的乳齿组织破碎至平均粒径50-200目，加入终浓度3mg/mL的中性蛋白酶I和0.25mg/mL的胰蛋白酶处理30min，反复吹打，加入含5％BSA的Hanks液终止反应，取上清离心后重悬得牙本质细胞。

5.如权利要求1所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(2)包括将分离的牙髓细胞和牙本质细胞混合在含有10％胎牛血清的1640培养液中进行原代培养，每24h换液，72h后消化继代。

6.如权利要求1所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(3)包括将携带Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种因子的逆转录病毒载体及病毒包装质粒共转染至原代或继代培养的乳齿细胞。

7.如权利要求1所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(4)包括：将体外合成的端粒酶催化亚基mRNA分子转入步骤(3)制备的细胞，使其瞬时表达端粒酶，接种于鼠胚胎成纤维细胞上，加入人胚胎干细胞培养基进行培养。

8.如权利要求7所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述端粒酶mRNA分子的序列根据已知的端粒酶催化亚基cDNA分子确定，包括编码区5’端的Cap结构以及3’端的poly(A)结构。

9.如权利要求1所述人乳齿细胞诱导重编程的方法，其特征在于所述步骤(5)多能性鉴定包括碱性磷酸酶染色试验和畸胎瘤形成试验。