[发明专利]一种EGFR基因突变检测的引物探针组合及其应用

说明书

本发明涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种EGFR基因突变检测的引物探针组合及其应用，所述引物探针组合包括检测引物探针，所述检测引物探针包括EGFR基因突变检测特异性引物对、EGFR基因特异性探针、扩增阻断探针和内参系统；其中，所述EGFR基因的突变检测的位点为18‑21外显子突变位点。本发明对EGFR基因突变具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，可以对肿瘤组织样本进行检测，能够辅助临床治疗，具有重要价值。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因突变的检测产品，具体涉及一种EGFR基因突变检测的引物探针组合及其应用。

背景技术

肺癌和结直肠癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因。其中以非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)和结直肠癌临床治疗的重要手段。大量研究资料表明EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区(tyrosine kinase coding domain，TKI)的18-2l外显子上，而这些突变与吉非替尼药物反应性有关，原因可能是这些突变改变了EGFR胞内ATP结合区的结构，提高了EGFR对吉非替尼的结合能力。虽然已报道不下30种突变与药物反应有关，但是主要是19外显子的框内缺失(746-753)性突变，约占所有突变的45％；21外显子的替代突变(主要是L858R和L861Q)，约占所有突变的40-45％，目前普遍认为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对TKI的敏感性，并且可作为TKI治疗的有效预测指标。18外显子G719X约占突变5％，20外显子插入突变占1％。2005年发现了能够从50％耐药病人身上检测到外显子20上的T790M突变。2013年证实了EGFR胞外区域的S492R突变可诱导结直肠癌患者使用西妥昔单抗无效，而该突变则对帕尼单抗的效用无影响。因此，检测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。

目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌(NSCLC)临床治疗的重要手段，而靶向药物的施用与EGFR基因突变有关。对非小细胞肺癌和结直肠癌患者细胞的19外显子缺失突变、20外显子的T790M和21外显子的L858R和L861Q点突变进行定性检测，检测结果用于辅助临床医生对非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤患者制定最为适合病人的个体化肿瘤治疗方案。

对EGFR突变的检测方法有直接测序法、突变体富集PCR、ARMS-PCR、高分辨率熔解曲线(HRM)以及TaqMan-MGB法等，直接测序敏感性低，费用高；突变富集体PCR容易造成PCR的污染而导致假阳性；HRM对模板的要求高，敏感度不高；TaqMan-PCR在敏感度和准确性上均有所提高，但是ARMS-MGB法要比TaqMan-PCR敏感度、准确性还高，且特异性很高。因此，利用与ARMS-MGB法荧光定量PCR技术检测EGFR突变能够可以筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。

ARMS-PCR(Amplification Refractory Mutation System，突变扩增阻滞系统)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。ARMS技术利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因(即利用特异引物对突变靶序列进行高精准的PCR扩增放大)；同时利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。